骨骼肌PGC-1α在調(diào)脂導(dǎo)致的胰島素抵抗中的作用機(jī)制.pdf

1、胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是2型糖尿病的重要發(fā)病機(jī)制，也是早期預(yù)防的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。高脂是誘發(fā)IR的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。
　　過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子-1α(peroxisomeproliferator-activated receptorγcoactivator1α，PGC-1α)是一種核轉(zhuǎn)錄共激活因子，可調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生、脂肪酸氧化、糖代謝等諸多生物過(guò)程。它與脂肪酸代謝和胰島素敏感性關(guān)系密

2、切。研究表明高脂飲食大鼠骨骼肌甘油三酯(TG)升高，PGC-1αmRNA和蛋白表達(dá)下降。在體實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)PGC-1α增加了骨骼肌脂質(zhì)利用，降低肌內(nèi)脂質(zhì)含量，同時(shí)改善了胰島素信號(hào)，表現(xiàn)為磷酸化的蛋白激酶B(AKT)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)表達(dá)升高，增加了氧消耗。這表明高脂導(dǎo)致的胰島素抵抗可能與PGC-1α下調(diào)有關(guān)。
　　STARS(Striated activator of Rho signaling或Actin bin

3、ding Rhoactivator)是一種在心肌、骨骼肌和平滑肌特異表達(dá)的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者骨骼肌STARS的表達(dá)增加，且與胰島素敏感性呈負(fù)相關(guān)。但是在給予急性耐力鍛煉后，發(fā)現(xiàn)骨骼肌STARS表達(dá)升高，同時(shí)PGC-1α以及脂肪酸氧化的限速酶肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(CPT-1β)表達(dá)也升高，抑制STARS可以降低CPT-1β的表達(dá)。STARS可能作為PGC-1α的下游靶點(diǎn)，發(fā)揮影響脂肪酸代謝的作用。STARS是否是PGC

4、-1α的下游靶點(diǎn)，并通過(guò)進(jìn)一步調(diào)控CPT-1β的表達(dá)影響脂肪酸代謝，進(jìn)而影響胰島素敏感性尚不清楚。
　　本課題通過(guò)高脂飲食喂養(yǎng)的SD大鼠，造成胰島素抵抗模型，分析骨骼肌PGC-1α，STARS及胰島素信號(hào)通路中胰島素受體底物-1(IRS-1)、AKT、GLUT4的表達(dá)變化。進(jìn)一步采用棕櫚酸孵育L6成肌細(xì)胞，構(gòu)建骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗模型，并通過(guò)質(zhì)粒和小干擾RNA(small interferenceRNA，siRNA)技術(shù)調(diào)節(jié)肌細(xì)胞

5、PGC-1α的表達(dá)，分析肌細(xì)胞STARS、脂肪酸氧化代謝和胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化，在細(xì)胞水平分析PGC-1α、STARS、CPT-1β與胰島素抵抗的關(guān)系，探討PGC-1α在高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗中的作用機(jī)制，為研發(fā)防治胰島素抵抗和2型糖尿病的藥物提供新的作用靶點(diǎn)和理論依據(jù)。本研究分以下兩部分:
　　第一部分高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠骨骼肌PGC-1α和STARS的表達(dá)
　　目的:構(gòu)建高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠模

6、型，分析大鼠骨骼肌PGC-1α、STARS及胰島素信號(hào)通路中各指標(biāo)的表達(dá)變化。
　　方法:24只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，體重125-145g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為兩組:對(duì)照組(C)12只，給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng);高脂組(HF)12只，給予高脂飼料喂養(yǎng)?；A(chǔ)飼料熱量組成:碳水化合物65.5％，蛋白24.2％脂肪10.3％;高脂飲食熱量組成:碳水化合物20.1％，蛋白20.1％，脂肪59.8％。喂養(yǎng)6周后，應(yīng)用清醒

7、狀態(tài)下高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)評(píng)估胰島素抵抗模程度。6周后自腹主動(dòng)脈處取血，處死大鼠，留取股四頭肌。測(cè)定大鼠血總膽固醇(TC)、TG、血糖(Blood glucose，BG)及血清胰島素(insulin，INS)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QuantitativeReal-time PCR)檢測(cè)骨骼肌組織PGC-1α、STARS及胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、兩組大鼠生化指標(biāo)變化
　　與對(duì)照組相比，

8、高脂組BG（6.38±0.23 mmol/L vs4.05±0.14 mmol/L）、INS(19.64±1.50 mU/L vs11.70±0.86 mU/L)、TC(1.17±0.06 mmol/L vs1.04±0.08 mmol/L)及TG(0.75±0.12 mmol/L vs0.31±0.02 mmol/L)均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。
　　2、兩組大鼠胰島素敏感性的比較
　　高脂組葡

9、萄糖輸注率(GIR)明顯低于對(duì)照組(14.74±0.42 mg·kg-1·min-1vs27.61±0.56 mg·kg-1·min-1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、兩組大鼠骨骼肌PGC-1α和STARS基因表達(dá)
　　與對(duì)照組相比，高脂組骨骼肌PGC-1αmRNA表達(dá)顯著降低，STARSmRNA表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　4、兩組大鼠胰島素信號(hào)通路的基因表達(dá)<

10、br>　　與對(duì)照組相比，高脂組骨骼肌IRS-1、AKT、GLUT4的mRNA表達(dá)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1、高脂飲食引起大鼠血脂增高，空腹血糖及胰島素水平升高，葡萄糖輸注率明顯下降，導(dǎo)致胰島素抵抗。
　　2、高脂飲食下調(diào)骨骼肌PGC-1α及胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，上調(diào)STARS的基因表達(dá)。
　　第二部分 PGC-1α在棕櫚酸誘導(dǎo)的肌細(xì)胞胰島素抵抗中的作用機(jī)制

11、>　　目的:分析PGC-1α、STARS、CPT-1β以及胰島素信號(hào)通路在棕櫚酸誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗中的表達(dá)變化，探討PGC-1α在高脂導(dǎo)致的胰島素抵抗中的分子機(jī)制。
　　方法:培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化大鼠L6成肌細(xì)胞為骨骼肌細(xì)胞，將骨骼肌細(xì)胞隨機(jī)分為兩組:對(duì)照組(Con)和棕櫚酸組(PA)，建立棕櫚酸誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗模型。將Con組隨機(jī)分為5個(gè)亞組:對(duì)照組(Con)，空質(zhì)粒組(pcDNA3)， PGC-1α過(guò)表達(dá)組(pcD

12、NA3/PGC-1α)，siRNA陰性對(duì)照組(NC-siRNA)，PGC-1α敲低組(si-PGC-1α)。將PA組隨機(jī)分為3個(gè)亞組:棕櫚酸組(PA)，棕櫚酸空質(zhì)粒組(PA+pcDNA3)，棕櫚酸PGC-1α過(guò)表達(dá)組（PA+ pcDNA3/PGC-1α）。轉(zhuǎn)染成功后，采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)各組細(xì)胞葡萄糖利用率評(píng)價(jià)胰島素敏感性，采用Real-time PCR檢測(cè)各組PGC-1α、STARS及脂肪酸氧化關(guān)鍵酶CPT-1β，胰島素信號(hào)通路中I

13、RS-1、AKT、GLUT4的mRNA表達(dá)，采用Western-blot的方法檢測(cè)PGC-1α、STARS及脂肪酸代謝關(guān)鍵酶ACC及其磷酸化蛋白水平，胰島素信號(hào)通路中IRS-1、p-IRS-1、AKT、p-AKT及GLUT4的蛋白表達(dá)量。多樣本間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析，兩樣本間比較采用t檢驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1、L6成肌細(xì)胞分化成功鑒定
　　與未分化組細(xì)胞相比，分化組細(xì)胞分化標(biāo)志性基因Desmin和Myo

14、genin的表達(dá)明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2、L6肌細(xì)胞PGC-1α、STARS及胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)
　　PA組葡萄糖含量較Con組明顯升高(14.91±2.42 mmol/L vs10.57±1.28 mmol/L)，胰島素敏感性下降。與Con組相比，PA組PGC-1α、IRS-1、AKT及GLUT4的mRNA的表達(dá)明顯下降，STARS基因表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05

15、）。
　　3、上調(diào)PGC-1α表達(dá)對(duì)肌細(xì)胞STARS、脂肪酸氧化關(guān)鍵酶及胰島素信號(hào)通路的影響
　　轉(zhuǎn)染PGC-1α質(zhì)粒后，PGC-1α的基因及蛋白表達(dá)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），說(shuō)明PGC-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。與Con組相比，pcDNA3/PGC-1α組STARS基因及蛋白表達(dá)明顯下降（均P＜0.05）。與PA組相比，PA+pcDNA3/PGC-1α組STARS基因表達(dá)下降(P＜0.01)。pcDNA3/

16、PGC-1α組CPT-1β基因表達(dá)較Con組均明顯升高，p-ACC蛋白表達(dá)亦明顯增加（均P＜0.05）。與PA組相比，PA+pcDNA3/PGC-1α組CPT-1β基因表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。與Con組相比，pcDNA3/PGC-1α組IRS-1、AKT、GLUT4的mRNA表達(dá)明顯升高(均P＜0.05)，IRS-1和AKT總蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P＞0.05），p-IRS-1表達(dá)顯著降低，p-AKT的表達(dá)明顯升高，GLUT4的蛋白

17、表達(dá)明顯升高（均P＜0.05或P＜0.01）。與PA組相比，PA+pcDNA3/PGC-1α組的IRS-1、AKT及GLUT4的mRNA表達(dá)明顯升高（均P＜0.05）。
　　4、下調(diào)PGC-1α表達(dá)對(duì)肌細(xì)胞STARS、脂肪酸氧化及胰島素信號(hào)通路的影響
　　與Con組相比，NC-siRNA組的PGC-1α基因和蛋白表達(dá)均無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而si-PGC-1α組的PGC-1α的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)均

18、明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），表明PGC-1α的siRNA轉(zhuǎn)染成功。與Con組相比，si-PGC-1α組STARS基因和蛋白表達(dá)均明顯增高，CPT-1βmRNA表達(dá)顯著下降，p-ACC的蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。ACC蛋白的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與Con組相比，si-PGC-1α組IRS-1、AKT、GLUT4的mRNA表達(dá)均明顯下降，p-IRS-1的表達(dá)明顯升高，p-AKT以及

19、GLUT4的蛋白表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05或P＜0.01）。IRS-1和AKT總蛋白的表達(dá)較Con組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、棕櫚酸孵育造成大鼠骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取率減少，胰島素敏感性下降，同時(shí)伴有PGC-1α表達(dá)下降，STARS表達(dá)升高。
　　2、上調(diào)PGC-1α表達(dá)可以使得STARS表達(dá)下降，脂肪酸氧化關(guān)鍵酶CPT-1β表達(dá)增加，胰島素信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)表達(dá)升高。