基于數(shù)字PCR和等溫?cái)U(kuò)增的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法研究.pdf

1、截止至2014年，轉(zhuǎn)基因作物的種植面積已達(dá)1.8億公頃，超過350種品系在全球28個(gè)國家種植，越來越多的國家批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因作物的應(yīng)用，并且這些數(shù)字仍在快速增長中。隨著全球貿(mào)易自由化的加強(qiáng)和轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物和產(chǎn)品的檢測要求也不斷提高。由于轉(zhuǎn)基因作物構(gòu)建的復(fù)雜化、品系數(shù)量的增加和時(shí)有發(fā)生的作物或產(chǎn)品中低水平混雜轉(zhuǎn)基因成分等情況，迫切需要具有高靈敏度、精準(zhǔn)、快速等特點(diǎn)的檢測方法以滿足轉(zhuǎn)基因檢測的需求。數(shù)字PCR及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)

2、增技術(shù)（LAMP）的出現(xiàn)及其應(yīng)用，顯示其在轉(zhuǎn)基因檢測中可能具有良好的應(yīng)用前景。本研究重點(diǎn)圍繞數(shù)字PCR和LAMP技術(shù)，開展轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品精準(zhǔn)和快速檢測方法的研究工作。
　　第一部分是比較三大不同原理的主要數(shù)字 PCR平臺(tái)，并探究其在轉(zhuǎn)基因生物領(lǐng)域的適用性。本研究從動(dòng)態(tài)范圍、絕對(duì)定量、相對(duì)定量、重復(fù)性等方面分析比較了三大數(shù)字PCR平臺(tái)的精確定量能力。并進(jìn)一步將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因生物精確定量、拷貝數(shù)分析及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值測定三個(gè)方面。
　　

3、數(shù)字PCR是一種基于泊松分布法的核酸分子絕對(duì)定量檢測方法。與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR真正實(shí)現(xiàn)了對(duì)核酸分子的精確及絕對(duì)定量，因此已被廣泛應(yīng)用于多種研究領(lǐng)域。我們的研究表明三種數(shù)字PCR平臺(tái)在轉(zhuǎn)基因絕對(duì)定量檢測中其結(jié)果精確度較高。由于分液數(shù)較多，ddPCR和3D-dPCR平臺(tái)比cdPCR擁有更為廣闊的絕對(duì)和相對(duì)定量范圍。另外，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品量值檢測、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值和轉(zhuǎn)基因生物外源拷貝數(shù)分析中的應(yīng)用研究均表明數(shù)字PCR是一種理想及適合的轉(zhuǎn)

4、基因檢測方法。
　　第二部分是一種核酸高通量可視化檢測平臺(tái)CALM（Capillary Array-basedLAMPforMultiplexvisual detection of nucleic acids）的建立及其在轉(zhuǎn)基因檢測中的應(yīng)用。CALM是一種基于親疏水處理毛細(xì)管陣列和可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的核酸多指標(biāo)便攜式快速分析平臺(tái)，具有高通量、尺寸微小、低成本及操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。在CALM平臺(tái)中，毛細(xì)管陣列上下兩面被處理成超疏水

5、性，不同LAMP引物組被預(yù)先固定在相應(yīng)毛細(xì)管內(nèi)壁上。這種設(shè)計(jì)使得LAMP反應(yīng)體系可以利用虹吸作用一次性加入到毛細(xì)管陣列中所有的毛細(xì)管內(nèi)而在毛細(xì)管間相互分隔。經(jīng)過并行進(jìn)行的LAMP反應(yīng)后，反應(yīng)結(jié)果可以直接通過肉眼讀出。在此平臺(tái)基礎(chǔ)上,我們成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)于八種非常重要和常用的轉(zhuǎn)基因作物相關(guān)基因的并行檢測。檢測結(jié)果表明本平臺(tái)具有較高的特異性和靈敏度。此外，從海關(guān)收集到的轉(zhuǎn)基因作物真實(shí)樣本的檢測結(jié)果與獨(dú)立進(jìn)行的real-time PCR結(jié)果完全一