轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因馬鈴薯與阪崎腸桿菌的熒光PCR和數(shù)字PCR檢測.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因的安全性成為社會關(guān)注的熱點，各國都相繼出臺了關(guān)于標識轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的法規(guī)，而市場準入的關(guān)鍵就在于定性或者定量的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)。本研究對轉(zhuǎn)基因DAS-44406-6大豆品系、轉(zhuǎn)基因AV43-6-G7馬鈴薯品系分別進行5′-RACE，測出兩個品系外源基因片段和內(nèi)源基因重組的邊界序列，并按照邊界特異性序列設(shè)計出相應的引物探針對，首次建立了轉(zhuǎn)基因DAS-44406-6大豆品系和轉(zhuǎn)基因AV43-6-G7馬鈴薯品系的實時熒光PCR和數(shù)字PCR

2、檢測方法。轉(zhuǎn)基因DAS-44406-6大豆品系和轉(zhuǎn)基因AV43-6-G7馬鈴薯品系的熒光PCR檢測方法在模板DNA濃度為100 ng/反應時，檢測低限均為0.01%的轉(zhuǎn)基因含量；建立的轉(zhuǎn)基因DAS-44406-6大豆品系和轉(zhuǎn)基因AV43-6-G7馬鈴薯品系數(shù)字PCR檢測方法絕對靈敏度能準確定量到模板DNA濃度分別為0.01 ng/μL和0.001 ng/μL的轉(zhuǎn)基因樣品。數(shù)字PCR方法相比于傳統(tǒng)PCR檢測方法具有簡便快速、靈敏準確、可絕

3、對定量等特點，這對于轉(zhuǎn)基因品系的實際檢測具有很大的應用價值。
　　阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）可導致免疫力低下的新生兒神經(jīng)系統(tǒng)紊亂如腦膜炎以及患菌血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎等疾病，嬰幼兒配方奶粉是至今已知的最主要的感染途徑。而檢測阪崎腸桿菌的關(guān)鍵就在于實時熒光PCR和數(shù)字PCR檢測方法。本研究首次建立了微滴式數(shù)字PCR檢測阪崎腸桿菌的絕對定量檢測方法。根據(jù)阪崎腸桿菌的特異性基因序列，設(shè)計引物和熒光探針，并

4、進行篩選，和其它12種近緣的、食品中常見的其它菌種一起進行實時熒光PCR引物和探針的特異性以及檢測低限實驗，作為數(shù)字PCR的準備與參照。以阪崎腸桿菌基因組DNA制備絕對靈敏度與相對靈敏度的梯度稀釋DNA進行PCR的定量檢測，并確定和驗證檢測體系的穩(wěn)定性、精密度、線性范圍及檢測低限等指標。本研究建立的檢測阪崎腸桿菌的QX200數(shù)字PCR檢測方法定量檢測低限為5×10-5 ng/μL，達到實時熒光PCR方法檢測低限，同時在阪崎腸桿菌基因組濃

5、度等于5×10-6 ng/μL時，仍可以檢出病原菌，說明QX200數(shù)字PCR檢測方法靈敏度達到甚至超過實時熒光PCR方法。樣品DNA模板濃度為5×10-3 ng/μL時，在阪崎腸桿菌基因組DNA相對含量區(qū)間為1.5625%-100%情況下具有較好的定量檢出阪崎腸桿菌的能力；在樣品模板濃度為5×10-3 ng/μL且阪崎腸桿菌在0.78125%-1.5625%時，也可以實現(xiàn)痕量阪崎腸桿菌樣品的檢出。首次建立的數(shù)字 PCR檢測方法具有較高的