RPA等溫擴(kuò)增技術(shù)在轉(zhuǎn)基因水稻檢測中的應(yīng)用.pdf

1、自1996年轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植以來，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已經(jīng)增長超過100倍，涉及的轉(zhuǎn)基因物種也在逐年增加。對于轉(zhuǎn)基因生物安全，公眾的關(guān)注程度也越來越高，各國政府的監(jiān)管力度越來越強。我國的轉(zhuǎn)基因水稻研究一直比較活躍，然而作為大部分中國人的主糧，公眾對轉(zhuǎn)基因水稻的接受程度還比較低。轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)成為轉(zhuǎn)基因生物安全工作的熱點研究內(nèi)容。因此，建立一套快速、靈敏、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因檢測方法是當(dāng)前十分必要的一項工作。
　　傳統(tǒng)的PCR檢測法無

2、法滿足田間、野外等簡陋環(huán)境中的現(xiàn)場檢測，因此，能克服此缺陷的等溫擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)運而生。在眾多的等溫擴(kuò)增技術(shù)中，本研究選擇了重組酶介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase polymerase amplification，RPA)。RPA技術(shù)是一種反應(yīng)溫度最接近室溫，快速、靈敏的等溫擴(kuò)增技術(shù)。它對DNA的擴(kuò)增溫度控制在25～42℃即可，反應(yīng)時間只要15～20 min。本研究利用RPA技術(shù)對轉(zhuǎn)基因水稻mF-MH3301-1、轉(zhuǎn)基因水稻Bar6

3、8-1、轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15、轉(zhuǎn)基因水稻KMD1等我國自主研發(fā)的并具有產(chǎn)業(yè)化前景的四種轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行了研究。
　　本研究根據(jù)轉(zhuǎn)基因水稻mf-MH3301-1品系外源基因插入側(cè)翼序列，篩選到一組檢測效果好的引物和探針，建立了RPA的瓊脂糖凝膠電泳和RPA熒光快速檢測方法，RPA熒光快速檢測可穩(wěn)定檢測100拷貝的轉(zhuǎn)基因水稻mf-MH3301-1。
　　根據(jù)轉(zhuǎn)基因水稻PA110-15品系和轉(zhuǎn)基因水稻Bar68-1品系的外源基

4、因側(cè)翼序列，分別篩選了一組引物探針組合，并分別建立了一套包含RPA瓊脂糖凝膠電泳、RPA熒光快速檢測以及RPA測流免疫試紙條快速檢測方法，其中RPA熒光快速檢測法的檢測限分別為500拷貝和50拷貝，RPA測流免疫試紙條法的檢測限分別為75拷貝和50拷貝。
　　針對轉(zhuǎn)基因水稻KMD1的檢測，本研究選取其外源基因5'端側(cè)翼序列，并設(shè)計篩選出特異引物，建立了該品系的RPA-瓊脂糖凝膠電泳檢測法。篩選到一條適用于特異性檢測的探針。