TLR-RIG信號通路相關(guān)基因克隆與功能研究.pdf

1、本文立足于TLR、RIG干擾素信號通路,研究了該信號通路中有關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能,以及它們在病毒刺激中的應答,同時,本文還選取了SKIV(Spottedknife iridovirus)病毒的一個基因-FLP(Ftsk Like Protein),作為研究該病毒致病、染色體復制與包裝的出發(fā)點。
　　 (1)在TLR信號通路中,IRF5/7(Interferon Regulatory Factor5/7)在其中具有重要的意義,通過生

2、物信息學分析,發(fā)現(xiàn)斑馬魚的IRF7蛋白與人類IRF7蛋白的同源度很低,通過RACE技術(shù),對斑馬魚zfIRF5/7二個基因進行了克隆。zfIRF7編碼423個氨基酸,QRT-PCR表明其mRNA表達在腦,心臟含量比較高,而zfIRF5編碼297個氨基酸,組織表達具有廣譜性,這2個基因在胚胎發(fā)育6hpi時mRNA相對含量較高,隨著胚胎的發(fā)育成熟而慢慢降低,最后趨于穩(wěn)定。將zfIRF7的熒光表達載體進行斑馬魚胚胎顯微注射實驗,沒有發(fā)現(xiàn)斑馬魚在

3、胚胎發(fā)育中有畸形。zfIRF5繼哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的9種IRF5剪接體后的又一種新發(fā)現(xiàn)的IRF5剪接體分子,它作為zfIRF5全長的一部分,只具有N端的IRF結(jié)構(gòu)域,而缺失C端IRF3結(jié)構(gòu)域。在L8G5-LUC熒光素酶報告基因活性分析實驗中,zfIRF5與zfIRF7一樣可以激活基因的轉(zhuǎn)錄,而且C端比全長還要強1.5倍。IRF5/7可以激活I(lǐng)SRE信號通路,但是IRF7可以激活I(lǐng)NF-β信號通路而zfIRF5沒影響,同時zfIRF7在I

4、SRE,INF-β的這種激活活性可以被zfIRF5所抑制。在熒光共定位實驗中,zfIRF7可以促進zfIRF5定位在細胞核,為IRF5蛋白的入核提供了一個全新的佐證。通過CO-IP實驗,確定zfIRF5可以與zfIRF7相互作用。斑馬魚在POLY(I:C)、LPS的刺激后,zfIRF7基因在12小時表達開始上升,但是zfIRF5對此并不敏感。ISKNV(Infectious spleen and kidney necrosis viru

5、s)感染斑馬魚后、zfIRF7在感染48后表達開始急劇上升,zfIRF5的變化不明顯。誘導表達和純化了zfIRF5/7的融合蛋白,并獲得了相應的兔源多克隆抗體,為將來的功能研究奠定基礎。
　　 (2)MAVS(mitochondrial anti-viral signaling protein)是RIG信號通路中重要蛋白,在NCBI河鲀的數(shù)據(jù)庫中,我們發(fā)現(xiàn)了一個類似MAVS的蛋白的分子,利用已知的染色體DNA片段序列,對該基因進

6、行了5'、3'RACE,得到了2630bp的該基因全長序列,其ORF全長1656bp,編碼551個氨基酸,利用該ORF片段,構(gòu)建了系列載體,對它們進行了系列的功能研究。在生物信息學分析表明,MAVS-like含有一個CARD、一個PRO-rich、三個GLA-rich和一個TM跨膜結(jié)構(gòu)域,這些特征是已知的MAVS所相似的。我們對河純MAVS-like基因的組織分布做了定量分析,MAVS-like在肝臟,肌肉中含量很高。利用LPS、PGN

7、、poly(I:C)對河純進行刺激時,發(fā)現(xiàn)MAVS-like的mRNA水平對LPS、PGN的刺激不敏感,在poly(I:C)的刺激下急劇下降,當ISKNV感染河鲀時,MAVS—like的mRNA水平也下調(diào)。通過ISRE,NF-κB信號通路的信號傳導實驗,表明MAVS-like可以激活這兩條信號通路,MAVS-like缺失PRO-RICH domain后,信號強度明顯增強,當該基因缺少TM區(qū)域時,則抑制信號的傳導的:在熒光定位實驗中,MA

8、VS-like無法定位在線粒體,而是定位在細胞膜的附近,這與編碼ORF的第1,2和4號外顯子有關(guān)系,當1,2號外顯子一起缺少,或者4號外顯子缺失,該突變體都不象全長一樣定位在細胞膜附近,但是缺失TM區(qū)域,對細胞的定位沒有明顯的影響。在實驗中,PRO-rich缺失的GFP融合蛋白在細胞中形成明亮的點狀,而PRO-rich domain可以阻止這種明亮GFP點的形成。通過CO-IP實驗,證明MAVS-like與zfTRAF3可以相互作用；利

9、用原核表達系統(tǒng),得到MAVS-like的兔多抗。利用真核、原核表達蛋白,通過Far-Western Blot實驗,確認MAVS-like的CARD domain可以相互作用。
　　 (3)SKIV是感染魚類的一種重要的病毒,通過生物信息學分析表明該病毒的FLP(Ftsk Like Protein)基因,可能參與了病毒基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,宿主的信號傳導以及病毒本身染色體的復制,病毒包裝與成熟等機制,因此,我們克隆了該基因,并構(gòu)建了一系

10、列的載體。FLP由3762個堿基編碼1253個氨基酸,是SKIV,也可能是虹彩病毒中分子量最大的一個蛋白。FLP含有一個SAP,一個FtsK和一個Glu domain,SAPdomain只在真核生物中有發(fā)現(xiàn),FtsK domain則一般發(fā)現(xiàn)在原核生物中,而Gludomain則在原核,真核中都有發(fā)現(xiàn),SKIV中發(fā)現(xiàn)的這個基因,可能具有這3種domain,將真核,原核,病毒各進化層次的物種所具有的domain融合在一起。細胞定位實驗表明該基

11、因全長部分入核,分別包含有上敘3種domain的片段都完全入核,因此可以推斷它最少具有3個NLS,因此,它入核信號的調(diào)節(jié)信號應該是很復雜的。實驗表明該蛋白是一個抑制型轉(zhuǎn)錄因子,抑制宿主的NF-κB,INF-β信號通路,甚至還可以抑制宿主的Glu酶的活性。QRT-PCR表明,它在MCP的表達之后,所以該基因是一個晚期表達基因。
　　 此外,構(gòu)建了FLP-RNAi載體,可以為后期的工作作準備,同時,鑒定了FtsK domain不定位