大黃魚Toll樣受體免疫信號傳導(dǎo)通路相關(guān)基因克隆與表達.pdf

1、大黃魚(Pseudosciaena crocea)是我國特有的經(jīng)濟魚種，以其味道鮮美，營養(yǎng)豐富和極高的藥用價值而受到青睞。人工養(yǎng)殖迅猛發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化，導(dǎo)致病害頻發(fā)，由此造成的經(jīng)濟損失也十分嚴重。因此，加強對大黃魚免疫學(xué)理論的基礎(chǔ)研究，了解其抗病免疫機制，對于大黃魚病害防治十分重要。
　　 Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)通過識別病原體結(jié)構(gòu)中保守的病原分子模式(PAMP

2、)構(gòu)成了機體抗感染的第一道防線。TLRs通過對病原識別后，與下游的接頭因子MyD88、TRAF6結(jié)合，激活下游的炎癥效應(yīng)因子殺滅病原體。TLRs信號傳導(dǎo)途徑以反應(yīng)快、作用廣，在抵抗病原體的侵襲中發(fā)揮更重要的作用，并對獲得性免疫的發(fā)生和類型起重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 本研究利用RT-PCR和RACE-PCR技術(shù)克隆了大黃魚TLR9、MyD88、TRAF6基因全長cDNA序列，研究了它們在大黃魚不同組織的表達譜。病原菌溶藻弧菌(Vib

3、rioalginolyticus)免疫刺激后，采用Real-TimePCR分析了免疫刺激不同時間后大黃魚脾臟、血液及肝臟中TLR9，MyD88，TRAF6在轉(zhuǎn)錄水平上的表達變化。結(jié)果表明：(1)大黃魚TLR9基因分為A和B兩種類型。TLR9AcDNA全長3637bp，編碼區(qū)3171bp可編碼1056個氨基酸，預(yù)測分子量121.385kDa；TLR9BcDNA3756bp，編碼區(qū)3021bp可編碼1006個氨基酸，預(yù)測分子量115.247

4、kDa。TLR9A與TLR9B存在LRR及TIR功能結(jié)構(gòu)域，TIR結(jié)構(gòu)域高度保守。TLR9A型TIR結(jié)構(gòu)域包含3個保守的Box，與TLR9A相比TLR9B的TIR功能結(jié)構(gòu)域區(qū)域較短，缺少保守的Box3。(2)MyD88基因cDNA全長1574bp，編碼區(qū)864bp編碼287個氨基酸的蛋白前體，預(yù)測分子量為33.075kDa。(3)TRAF6cDNA全長2013bp，編碼區(qū)1725bp，可編碼574個氨基酸的蛋白前體，預(yù)測分子量為64.7

5、27kDa。(4)對上述基因的組織表達譜的結(jié)果表明，TLR9A、TLR9B、MyD88、TRAF6作為同一信號傳導(dǎo)通路的基因，廣泛存在于大黃魚的大部分組織，并且表現(xiàn)出相似的表達特征：其中，脾臟中表達量最高，肌肉中表達量最低。溶藻弧菌誘導(dǎo)后，大黃魚脾臟、肝臟、血液中TLR9A、TLR9B和MyD88基因表達量變化顯著；血液中TRAF6基因表達量變化顯著，而脾臟和肝臟中TRAF6基因表達量變化未達到顯著水平。提示TLRs信號傳導(dǎo)途徑在大黃魚