斑馬魚(yú)TLR信號(hào)通路TIRAP與MyD88分子的克隆表達(dá)及功能研究.pdf

1、斑馬魚(yú)胚胎透明，生長(zhǎng)速度快，斑馬魚(yú)基因與人類基因的相似度達(dá)到87％，這些優(yōu)點(diǎn)都足以使斑馬魚(yú)成為模式生物越來(lái)越受到科學(xué)家的寵愛(ài)。TLR(toll—like receptor)是近年來(lái)非常受關(guān)注的一種先天性免疫的模式識(shí)別受體(PRR： pattern recognition receptor)，在斑馬魚(yú)當(dāng)中也發(fā)現(xiàn)了很多的與哺乳動(dòng)物同源的TLR，因此，通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)TLR信號(hào)通路的研究有助我們更加了解斑馬魚(yú)和哺乳動(dòng)物的先天性免疫系統(tǒng)，為疾病的研

2、究提供良好的研究模式。 TIRAP和MyD88是TLR信號(hào)通路中兩個(gè)非常關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)銜接分子。本文通過(guò)5’RACE獲得了斑馬魚(yú)TIRAP分子的全長(zhǎng)序列，最大閱讀框包括四個(gè)外顯子，共338個(gè)氨基酸。序列分析發(fā)現(xiàn)與哺乳動(dòng)物的TIRAP相比較，斑馬魚(yú)TIRAP分子羧基端TIR結(jié)構(gòu)域較為保守，但是在BB環(huán)的頂部保守氨基酸脯氨酸被亮氨酸所取代：氨基端缺乏磷脂酰肌醇二磷酸PIP2結(jié)合位點(diǎn)。Real—Time PCR分析發(fā)現(xiàn)，正常狀態(tài)下，斑

3、馬魚(yú)TIRAP遍布于各個(gè)組織當(dāng)中，在精巢當(dāng)中表達(dá)量相對(duì)較高。用Aeromonas salmonicida感染斑馬魚(yú)成魚(yú)后，TIRAP的組織分布有所變化，仍然遍布于所有的組織器官，但是在腎臟，脾臟，精巢和卵巢中的表達(dá)量偏高。 將融合了GFP的斑馬魚(yú)TIRAP以及MyD88表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，對(duì)TIRAP的定位進(jìn)行研究，結(jié)果顯示斑馬魚(yú)TIRAP全長(zhǎng)分子遍在分布于整個(gè)細(xì)胞，TIRAP的剪接體TIRAP—△(1-105)在整個(gè)細(xì)胞

4、質(zhì)中都有表達(dá)，而只含有TIR結(jié)構(gòu)域的TIRAP的細(xì)胞定位模式與全長(zhǎng)類似。斑馬魚(yú)的MyD88分子則聚集成團(tuán)以點(diǎn)狀的形式特異性散狀地分布于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。 熒光素酶檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果顯示斑馬魚(yú)TIRAP分子不能激活NF—κB，而MyD88能誘導(dǎo)NF—κB大量表達(dá)，我們分析認(rèn)為斑馬魚(yú)TIRAP分子不能定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，從而導(dǎo)致了功能的散失。我們將斑馬魚(yú)MyD88第188位即BB環(huán)頂部的脯氨酸突變成了亮氨酸、精氨酸和組氨酸，只有亮氨酸的突變?nèi)匀豢?/p>

5、以傳遞信號(hào)，組氨酸和精氨酸的突變都導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)被抑制，推測(cè)BB環(huán)的頂部是疏水性氨基酸(脯氨酸和亮氨酸)的時(shí)候，可以進(jìn)行信號(hào)傳遞；當(dāng)被親水性氨基酸(精氨酸和組氨酸)取代時(shí)，信號(hào)傳遞被抑制。同時(shí)利用免疫共沉淀的方法進(jìn)一步確證斑馬魚(yú)TLR4a可以與MyD88相互作用，而不能與TIRAP相互作用。 我們還通過(guò)使用了6種純組分(LPS，Zymosan，Glucan，polyI：C，LTA and PGN)刺激斑馬魚(yú)成魚(yú)，來(lái)研究病原微生物與

6、魚(yú)類特有TLR分子相對(duì)應(yīng)識(shí)別的關(guān)系。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)的TLR21.1、TLR21.2、TLR21.3和TLR21.4可以識(shí)別各種不同的微生物包括革蘭式陽(yáng)性和陰性細(xì)菌、真菌、以及病毒等。斑馬魚(yú)特有的TLR21.3在Zymosan的誘導(dǎo)下，表達(dá)量高度上調(diào)，因此斑馬魚(yú)TLR21.3極有可能是酵母特異的受體分子。免疫共沉淀試驗(yàn)驗(yàn)證了斑馬魚(yú)TLR21家族的成員都可以和斑馬魚(yú)MyD88相互作用。 綜上所述，通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)TLR系統(tǒng)的一些研究