重組人乳鐵蛋白對一代延長試驗大鼠免疫功能及神經(jīng)行為影響的實驗研究.pdf

1、目的：
　　研究轉人乳鐵蛋白牛乳腺生物反應器表達的重組人乳鐵蛋白（Recombinant human lactoferrin,rhLF）對子代大鼠免疫功能及神經(jīng)行為的影響。本研究開展了重組人乳鐵蛋白的一代延長試驗，目的是豐富重組人乳鐵蛋白的安全性評價資料，為風險管理和風險交流提供科學依據(jù)。
　　方法：
　　1.重組人乳鐵蛋白氨基酸組成檢測及重組人乳鐵蛋白飼料成分分析
　　運用國標方法對重組人乳鐵蛋白進行氨基酸分析

2、。重組人乳鐵蛋白全替換標準AIN-93G飼料中蛋白質(zhì)作為重組人乳鐵蛋白組飼料，標準AIN-93G飼料作為對照組飼料。飼料由北京華阜康飼料公司制作。由北京市營養(yǎng)源研究所對重組人乳鐵蛋白組飼料及對照組飼料進行營養(yǎng)成分檢測。
　　2.重組人乳鐵蛋白對子代大鼠免疫功能的影響
　　參照一代繁殖毒性擴展試驗指南（OECD443）進行免疫功能試驗，重點研究親代大鼠在孕期和哺乳期暴露rhLF對子代大鼠免疫功能的影響，以及子代大鼠在斷乳后持續(xù)

3、暴露rhLF對其免疫功能的影響。選擇PND0、PND21及PND56的子代大鼠進行相應的進行免疫功能評價。
　　SPF級11周齡Wistar大鼠，雌鼠60只，雄鼠30只，適應環(huán)境一周后，隨機分為對照組（酪蛋白）、重組人乳鐵蛋白組，按照蛋白20％的比例摻入飼料進行全食物喂養(yǎng)。雌雄大鼠喂養(yǎng)相應飼料兩周后進行交配，各組雌鼠在交配期、妊娠期和哺乳期繼續(xù)給予相應飼料，子代大鼠從斷乳到處死繼續(xù)給予相應飼料。子代大鼠PND0（出生后第0天）每窩

4、隨機選一只子代大鼠進行脾臟和胸腺淋巴細胞分型，保證每組20窩PND0子代大鼠要有雌鼠10只、雄鼠10只。子代大鼠PND4（出生后第4天），進行窩標準化，隨機剔除多余子代大鼠，調(diào)整為8只/窩，雌雄各半[4]，在PND0、7、14和21稱重。于PND21子代大鼠斷乳時，進行淋巴細胞分型（T/B/NK，CD3/CD4/CD8），每組20窩保證PND21檢測的子代大鼠中有雌鼠10只，雄鼠10只。子代大鼠于PND56(出生后第56天)進行淋巴細胞

5、分型和免疫功能評價試驗。
　　本研究參考人用藥物免疫毒性試驗指導原則（ICH S8），選取了血常規(guī)；血生化；外周血、脾、胸腺及潘氏結淋巴細胞表型分析（CD3/CD4/CD8、T/B/NK）；溶血空斑試驗（PFC）；淋巴細胞增殖試驗；NK細胞活性試驗等。指標涵蓋了體液免疫、細胞免疫和非特異性免疫。
　　3.重組人乳鐵蛋白對子代大鼠神經(jīng)行為的影響
　　3.1.子代大鼠早期生理發(fā)育組合測試
　　子代大鼠出生后以窩為單位

6、，在出生后特定的天數(shù)檢查子代大鼠成活率、性別比、出牙時間、耳廓分離時間、開眼時間和出毛時間等生理發(fā)育指標。
　　3.2.子代大鼠早期神經(jīng)發(fā)育組合測試
　　子代大鼠出生后以窩為單位，在出生后特定的天數(shù)檢查子代大鼠平面翻正、懸崖回避、空中翻正、前肢懸掛、聽覺驚嚇等神經(jīng)行為指標。各發(fā)育指標達標標準為：同窩所有子代大鼠該項指標均達標的天數(shù)。每組觀察20窩。
　　3.3.子代大鼠感覺運動測試
　　PND28重組人乳鐵蛋白組

7、和對照組每窩隨機挑選1只雄鼠或雌鼠（每組10只雄性和10只雌性）進行熱板測試、轉棒測試和抓力測試。
　　3.4.子代大鼠學習記憶行為學測試
　　在PND70分別從各組（重組人乳鐵蛋白組和對照組）隨機選取的雌雄大鼠各10只（每窩隨機挑選1只雄鼠或雌鼠）進行Morris水迷宮試驗，對子代大鼠學習記憶行為進行評價，觀察rhLF對子代大鼠學習記憶能力的影響。
　　結果：
　　1.重組人乳鐵蛋白氨基酸含量和組成檢測及重組人

8、乳鐵蛋白飼料成分分析
　　對重組人乳鐵蛋白與酪蛋白（casein，CAS）的17種氨基酸進行定量測定。飼料營養(yǎng)成分分析檢測結果表明，重組鐵蛋白飼料和酪蛋白飼料的主要營養(yǎng)成分含量接近。
　　2.重組人乳鐵蛋白對子代大鼠免疫功能的影響
　　與對照組比較，重組人乳鐵蛋白組子代大鼠血常規(guī)、血生化和淋巴細胞分型結果未見明顯改變；溶血空斑試驗（PFC）、淋巴細胞增殖試驗及NK細胞活性試驗，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

9、　　3.重組人乳鐵蛋白對子代大鼠神經(jīng)行為的影響
　　3.1.子代大鼠早期生理和神經(jīng)發(fā)育指標
　　子代大鼠出生后子代大鼠以窩為單位，檢查了子代大鼠早期生理發(fā)育指標（成活率、性別比、出牙時間、耳廓分離時間、開眼時間和出毛時間）和早期神經(jīng)發(fā)育指標(平面翻正、懸崖回避、空中翻正、前肢懸掛)，檢查結果顯示，測試結果顯示rhLF組和對照組之間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　3.2.子代大鼠感覺運動測試
　　選

10、擇傷害性知覺測試（熱板試驗）、平衡能力測試（轉棒試驗）、抓力測試于PND28對子代大鼠進行了感覺運動行為學測試，測試結果顯示rhLF組和對照組之間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　3.3.子代大鼠學習記憶測試
　　通過Morris水迷宮試驗，分析重組人乳鐵蛋白對子代大鼠學習記憶能力的影響，未發(fā)現(xiàn)重組人乳鐵蛋白對子代大鼠學習記憶功能有不良影響（P>0.05）。
　　結論：
　　1.與對照組比較，重組人