豬肺組織cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及APP OmpA酵母雙雜交的篩選.pdf

1、SiChUanAgriCU1tUra1UniVersitYDISSERTATIoNSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementforMASTERDEGREEConstructionofacDNAlibraryofswinelungtissueandyeasttwohybridScreenwithOutermembraneproteinAofActinobacilluspleuropneumo

2、niaeZhangqian(preventiveVeterinariarymedicine)DirectedbyProf舭nxintianCaosanjieChengdu，SichuanJune2015摘要豬傳染性胸膜肺炎(porcinecontagiouspleuropneumoniae，PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌似ctinobacilluspleuropneumoniae，APP)弓I起豬的一種呼吸道疾病，該病對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重

3、的經(jīng)濟(jì)損失。外膜蛋Et(outermembraneprotein，OMP)是胸膜肺炎放線桿菌的眾多毒力因子之一。本研究主要進(jìn)行了豬肺組織eDNA文庫(kù)構(gòu)建及APPOmpA酵母雙雜交陽(yáng)性克隆子篩選研究，為進(jìn)一步深入研究OmpA感染豬肺的致病機(jī)理奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，主要研究工作如下：1豬肺組織cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與鑒定以28日齡健康仔豬的肺組織為材料，Trizol法提取豬肺組織總RNA，分離純化mRNA，以Invitrogen反轉(zhuǎn)錄酶合成eDNA第一

4、鏈，經(jīng)LD—PCR擴(kuò)增得到雙鏈eDNA，再經(jīng)BDCHROMASPINColumns純化雙鏈eDNA，除去較小的片段，將eDNA與含有DNA激活域(DNAAD)的酵母表達(dá)載體pGADT7Rec連接，電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌DHl0B感受態(tài)中，收獲克隆子即為豬肺組織cDNA文庫(kù)，經(jīng)鑒定最終得到的eDNA文庫(kù)總?cè)萘繛?1xlO7cfu，插入片段平均長(zhǎng)度在15Kb左右，文庫(kù)陽(yáng)性克隆率為100％，證明該試驗(yàn)成功構(gòu)建了豬肺組織eDNA文庫(kù)，為豬肺部致病菌

5、的致病機(jī)理方面的研究奠定了基礎(chǔ)。2APP外膜蛋白OmpA酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定以豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型野毒株基因組全長(zhǎng)序列為模板，特異性引物擴(kuò)增去掉信號(hào)肽后的外膜蛋AOmpA片段。將該片段與含有DNA結(jié)合域(DNABD)的酵母表達(dá)載體pGBKT7一Rec連接，獲得pGBKT7OmpA誘餌載體，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定均獲得大小約為1，100bp的目的條帶；將該誘餌載體通過(guò)醋酸鋰法轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)AHl09細(xì)胞中，在加有卡那霉素的S

6、D／一Trp營(yíng)養(yǎng)缺陷性瓊脂培養(yǎng)基上收獲轉(zhuǎn)化子，即為pGBKT7OmpA誘餌菌，通過(guò)對(duì)該誘餌菌進(jìn)行自激活性檢測(cè)和細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果：該誘餌在SD／Trp／His、SD／Trp／Ade、SD／Trp／His／Ade／Leu缺陷性固體培養(yǎng)基上均無(wú)克隆生長(zhǎng)，且在SD／Trp、SD／Trp／X0【gal生長(zhǎng)為白色菌落，表明該誘餌菌不能自主激活報(bào)告基因HIS3、ADE2和MELl；在SD／一Trp液體培養(yǎng)基培養(yǎng)22h后，其菌液OD600值在08以上，