NOD1-NOD2介導的天然免疫應答對HBV持續(xù)復制的影響及其機制.pdf

1、目的：
　　1、探索 NOD1/NOD2介導的天然免疫應答對小鼠體內(nèi) HBV復制影響及其可能機制。
　　2、研究肝竇內(nèi)皮細胞(LSEC)在 NOD1/NOD2受體介導的抗 HBV免疫應答中的作用和機制。
　　方法：
　　1、尾靜脈高壓水注射 pAAV/HBV1.2質(zhì)粒建立慢性 HBV復制小鼠模型,并以尾靜脈高壓水注射方式把 NOD1/NOD2配體直接導入肝內(nèi)。
　　2、按既定時間點采取小鼠血標本,并取肝組織

2、及脾組織。用定量 ELISA檢測血清 HBsAg和HBeAg,定量 real time-PCR檢測血清中HBVDNA水平;ELISPOT檢測脾細胞中特異性分泌 IFNγ細胞數(shù);用免疫組織化學方法檢測肝組織中HBcAg的表達。
　　3、用膠原酶灌注與抗-LSEC免疫磁珠分離方法分離 C57BL/6小鼠LSEC。
　　4、應用Real-time RT-PCR檢測基礎水平 LSEC中NOD1/NOD2的表達。
　　5、用C1

3、2-ieDAP、MDP、ssRNA40配體刺激 LSEC,6h,20h收集細胞及細胞上清,定量 RT-PCR檢測:NOD1、NOD2、IL-6、RIP2、TNFα、CXCL-1、CXCL-2、CXCL-9、CXCL-10、CCL-2、CCL-3、CCL-5;ELISA檢測細胞上清中的細胞因子:IFNα/β/γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、, IL-18;流式細胞術檢測細胞表面分子:PD-L1、CD40、CD86、MHCII、CD1

4、06、CD54、CD80。
　　6、Graphpad軟件作圖,SPSS18.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：
　　1、NOD1配體 C12-ieDAP(20μg/只)高壓水注射處理明顯抑制了慢性 HBV復制小鼠血清中HBsAg、HBeAg及HBVDNA,肝組織中HBcAg表達也被抑制。而NOD2配體 MDP處理時未發(fā)現(xiàn)有抑制HBV復制效應,其余注射方法均未觀察到體內(nèi)的抗HBV效應。
　　2、NOD1配體 C12

5、-ieDAP高壓水注射處理后,脾臟中HBcAg特異的分泌 IFN-γ細胞數(shù)顯著增加。
　　3、基礎狀態(tài)下 LSEC中NOD1呈高度表達,而NOD2表達水平相對較低。
　　4、NOD1配體 C12-ieDAP激活 LSEC誘導 NOD1、RIP2、IL-6、CXCL-1、CXCL-2、CXCL-9、CCL-2和CCl-5等 mRNA水平上調(diào);NOD2配體 MDP激活 LSEC誘導 RIP2和IL-6 mRNA水平上調(diào);ssRN

6、A40(可能通過 NOD2途徑)刺激 LSEC誘導 RIP2、CXCL-2、CXCL-9、CXCL-10、CCL-2與 CCl-5等 mRNA水平上調(diào)。
　　5、NOD1與 NOD2配體刺激誘導 LSEC細胞因子的產(chǎn)生:C12-ieDAP10μg/ml刺激時有 IFN-γ效應分子產(chǎn)生;IL-6效應分子在不同配體不同濃度刺激下均有所產(chǎn)生,其中C12-ieDAP10μg/ml、MDP10μg/ml、ssRNA400.2μg/ml刺激下

7、可產(chǎn)生高水平 IL-6。而其它細胞因子(IL-1β、IL-18、TNF-α、IFN-α和IFNβ)均未檢測到。
　　6、LSEC受 C12-ieDAP(NOD1配體)刺激后 CD40、CD86和PD-L1上調(diào),未發(fā)現(xiàn) MHCII、CD106、CD54和CD80上調(diào)。且在5μg/ml濃度刺激下, CD40和CD86上調(diào)較明顯;在2μg/ml濃度刺激下, PD-L1上調(diào)較明顯。MDP(NOD2配體)刺激后 CD40、CD86和PD-L

8、1上調(diào),未發(fā)現(xiàn) MHCII、CD106、CD54和CD80上調(diào)。且在5μg/ml濃度刺激下, CD40、CD86和PD-L1上調(diào)較明顯。ssRNA40刺激后 PD-L1上調(diào),未發(fā)現(xiàn) CD40、CD86、MHCII、CD106、CD54和CD80上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1、在慢性 HBV復制小鼠模型中,NOD1激動劑在肝內(nèi)具有抗 HBV效應,而NOD2激動劑或肝外途徑運用NOD1激動劑均無抗 HBV效應。
　　2、NOD

9、1和NOD2在 LSEC中功能性表達,均能被其配體激活,并介導 NF-κB信號途徑活化產(chǎn)生 IL-6效應分子及一系列趨化因子;NOD1還介導產(chǎn)生 IFN-γ效應分子,而NOD2無此免疫應答效應。
　　3、NOD1介導的天然免疫應答對 HBV復制影響可能通過介導炎癥反應,募集中性粒細胞,產(chǎn)生 IFN-γ以及調(diào)控 HBcAg特異性的獲得性免疫應答發(fā)揮作用。
　　本研究的創(chuàng)新點：
　　1、發(fā)現(xiàn) NOD1介導的天然免疫應答可以

10、抑制對小鼠體內(nèi) HBV復制。
　　2、研究了LSEC中NOD1與 NOD2介導的信號途徑及其天然免疫應答效應。
　　3、初步闡明了NOD1介導的抗 HBV效應及其可能機制。
　　本研究的意義：
　　1、揭示了LSEC中NOD1與 NOD2是肝臟內(nèi)天然免疫的重要組成部分,與肝臟的炎癥、感染性疾病的發(fā)病密切相關。
　　2、NOD1參與了肝內(nèi)抗 HBV免疫應答,為探索 NOD1激動劑作為免疫調(diào)節(jié)劑和疫苗佐劑的應用