NOD1-NOD2介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答對(duì)HBV持續(xù)復(fù)制的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：
　　1、探索 NOD1/NOD2介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答對(duì)小鼠體內(nèi) HBV復(fù)制影響及其可能機(jī)制。
　　2、研究肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC)在 NOD1/NOD2受體介導(dǎo)的抗 HBV免疫應(yīng)答中的作用和機(jī)制。
　　方法：
　　1、尾靜脈高壓水注射 pAAV/HBV1.2質(zhì)粒建立慢性 HBV復(fù)制小鼠模型,并以尾靜脈高壓水注射方式把 NOD1/NOD2配體直接導(dǎo)入肝內(nèi)。
　　2、按既定時(shí)間點(diǎn)采取小鼠血標(biāo)本,并取肝組織

2、及脾組織。用定量 ELISA檢測(cè)血清 HBsAg和HBeAg,定量 real time-PCR檢測(cè)血清中HBVDNA水平;ELISPOT檢測(cè)脾細(xì)胞中特異性分泌 IFNγ細(xì)胞數(shù);用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝組織中HBcAg的表達(dá)。
　　3、用膠原酶灌注與抗-LSEC免疫磁珠分離方法分離 C57BL/6小鼠LSEC。
　　4、應(yīng)用Real-time RT-PCR檢測(cè)基礎(chǔ)水平 LSEC中NOD1/NOD2的表達(dá)。
　　5、用C1

3、2-ieDAP、MDP、ssRNA40配體刺激 LSEC,6h,20h收集細(xì)胞及細(xì)胞上清,定量 RT-PCR檢測(cè):NOD1、NOD2、IL-6、RIP2、TNFα、CXCL-1、CXCL-2、CXCL-9、CXCL-10、CCL-2、CCL-3、CCL-5;ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中的細(xì)胞因子:IFNα/β/γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、, IL-18;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子:PD-L1、CD40、CD86、MHCII、CD1

4、06、CD54、CD80。
　　6、Graphpad軟件作圖,SPSS18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1、NOD1配體 C12-ieDAP(20μg/只)高壓水注射處理明顯抑制了慢性 HBV復(fù)制小鼠血清中HBsAg、HBeAg及HBVDNA,肝組織中HBcAg表達(dá)也被抑制。而NOD2配體 MDP處理時(shí)未發(fā)現(xiàn)有抑制HBV復(fù)制效應(yīng),其余注射方法均未觀察到體內(nèi)的抗HBV效應(yīng)。
　　2、NOD1配體 C12

5、-ieDAP高壓水注射處理后,脾臟中HBcAg特異的分泌 IFN-γ細(xì)胞數(shù)顯著增加。
　　3、基礎(chǔ)狀態(tài)下 LSEC中NOD1呈高度表達(dá),而NOD2表達(dá)水平相對(duì)較低。
　　4、NOD1配體 C12-ieDAP激活 LSEC誘導(dǎo) NOD1、RIP2、IL-6、CXCL-1、CXCL-2、CXCL-9、CCL-2和CCl-5等 mRNA水平上調(diào);NOD2配體 MDP激活 LSEC誘導(dǎo) RIP2和IL-6 mRNA水平上調(diào);ssRN

6、A40(可能通過(guò) NOD2途徑)刺激 LSEC誘導(dǎo) RIP2、CXCL-2、CXCL-9、CXCL-10、CCL-2與 CCl-5等 mRNA水平上調(diào)。
　　5、NOD1與 NOD2配體刺激誘導(dǎo) LSEC細(xì)胞因子的產(chǎn)生:C12-ieDAP10μg/ml刺激時(shí)有 IFN-γ效應(yīng)分子產(chǎn)生;IL-6效應(yīng)分子在不同配體不同濃度刺激下均有所產(chǎn)生,其中C12-ieDAP10μg/ml、MDP10μg/ml、ssRNA400.2μg/ml刺激下

7、可產(chǎn)生高水平 IL-6。而其它細(xì)胞因子(IL-1β、IL-18、TNF-α、IFN-α和IFNβ)均未檢測(cè)到。
　　6、LSEC受 C12-ieDAP(NOD1配體)刺激后 CD40、CD86和PD-L1上調(diào),未發(fā)現(xiàn) MHCII、CD106、CD54和CD80上調(diào)。且在5μg/ml濃度刺激下, CD40和CD86上調(diào)較明顯;在2μg/ml濃度刺激下, PD-L1上調(diào)較明顯。MDP(NOD2配體)刺激后 CD40、CD86和PD-L

8、1上調(diào),未發(fā)現(xiàn) MHCII、CD106、CD54和CD80上調(diào)。且在5μg/ml濃度刺激下, CD40、CD86和PD-L1上調(diào)較明顯。ssRNA40刺激后 PD-L1上調(diào),未發(fā)現(xiàn) CD40、CD86、MHCII、CD106、CD54和CD80上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1、在慢性 HBV復(fù)制小鼠模型中,NOD1激動(dòng)劑在肝內(nèi)具有抗 HBV效應(yīng),而NOD2激動(dòng)劑或肝外途徑運(yùn)用NOD1激動(dòng)劑均無(wú)抗 HBV效應(yīng)。
　　2、NOD

9、1和NOD2在 LSEC中功能性表達(dá),均能被其配體激活,并介導(dǎo) NF-κB信號(hào)途徑活化產(chǎn)生 IL-6效應(yīng)分子及一系列趨化因子;NOD1還介導(dǎo)產(chǎn)生 IFN-γ效應(yīng)分子,而NOD2無(wú)此免疫應(yīng)答效應(yīng)。
　　3、NOD1介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答對(duì) HBV復(fù)制影響可能通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng),募集中性粒細(xì)胞,產(chǎn)生 IFN-γ以及調(diào)控 HBcAg特異性的獲得性免疫應(yīng)答發(fā)揮作用。
　　本研究的創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1、發(fā)現(xiàn) NOD1介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答可以

10、抑制對(duì)小鼠體內(nèi) HBV復(fù)制。
　　2、研究了LSEC中NOD1與 NOD2介導(dǎo)的信號(hào)途徑及其天然免疫應(yīng)答效應(yīng)。
　　3、初步闡明了NOD1介導(dǎo)的抗 HBV效應(yīng)及其可能機(jī)制。
　　本研究的意義：
　　1、揭示了LSEC中NOD1與 NOD2是肝臟內(nèi)天然免疫的重要組成部分,與肝臟的炎癥、感染性疾病的發(fā)病密切相關(guān)。
　　2、NOD1參與了肝內(nèi)抗 HBV免疫應(yīng)答,為探索 NOD1激動(dòng)劑作為免疫調(diào)節(jié)劑和疫苗佐劑的應(yīng)用