偽狂犬病毒多肽抗體的制備及神經元體外培養(yǎng)研究.pdf

1、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是豬α皰疹病毒。PRV侵入外周神經系統(tǒng)并在其中建立可再激活的感染。病毒通過軸突進入細胞核后（逆向運輸），病毒基因一般在細胞核內建立潛伏感染。經過數月甚至數年之后，潛伏感染可以再次被激活，產生新組裝的病毒顆粒。隨后病毒又運輸至外周神經系統(tǒng)（順向運輸），在外周神經系統(tǒng)附近再次感染的上皮細胞會產生感染性的病毒顆粒來感染幼小的宿主。病毒顆粒長距離的順向和逆向的運動需要依賴軸突中微管的快速

2、運輸機制。PRV通過受體介導膜融合進入軸突，這個時候病毒分離為病毒囊膜、糖蛋白、外層被膜蛋白和內層被膜蛋白。有一些病毒成分在軸突中是單獨運輸的，這種運輸影響細胞內的潛伏性感染或者增殖性感染。
　　為了能更進一步的研究PRV在神經細胞與上皮細胞之間的方向性傳輸，Ch'ng和Enquist發(fā)明了三室培養(yǎng)系統(tǒng)(triple-chamber system)，這種系統(tǒng)將神經元細胞體與軸突通過物理性的隔離而隔開。隨后又出現了另外一種不同于三室

3、培養(yǎng)系統(tǒng)的微流體系統(tǒng)(microfluidic chamber system)，可以被用做研究α皰疹病毒的蛋白對病毒在神經細胞軸突運輸中的影響。
　　由以上研究背景，本試驗通過設計多肽并注射到長耳兔，從而獲得PRV gB、VP16、VP26蛋白的高免血清。分離并培養(yǎng)雞胚脊髓背根神經元和新生小鼠海馬神經細胞。在微流體系統(tǒng)(microfluidic chamber system)中體外原代培養(yǎng)雞胚脊髓背根神經元，在軸突端或者胞體端接種

4、PRVΔUL21-EGFP重組病毒。在一定時間內收獲軸突端和胞體端的培養(yǎng)基，并分別測其毒價。通過分析軸突端和胞體端樣品毒價從而確定PRV被膜蛋白UL21在軸突順行及逆行運輸的作用。主要工作包括:
　　1.多抗的制備
　　根據gB、VP16、VP26蛋白的氨基酸序列，找出一段適合的序列設計多肽。將設計的多肽序列送公司合成。合成好的多肽溶液與弗氏佐劑混合注射至新西蘭長耳兔。免疫數次后用ELISA檢測血清的效價，達到要求后，對長耳

5、兔進行頸動脈采血。對血液進行離心并吸取上清，上清即為所需的血清。Western blot檢測所得到的血清。經過檢測后，這三種血清均含有相應蛋白的抗體。
　　2.小鼠海馬神經元的原代培養(yǎng)
　　選取出生24 h以內的新生小鼠，在解剖顯微鏡下分離獲取腦部的海馬組織。用即配的濃度為2mg/ml木瓜蛋白酶消化成單個的細胞，接種在六孔板或者小皿中，每三天換液一次，一次更換三分之一，每次換液需提前預熱培養(yǎng)基。培養(yǎng)10天左右進行觀察。通過間

6、接免疫熒光驗證所培養(yǎng)的細胞為小鼠海馬神經元。
　　3.微流體系統(tǒng)的建立及重組病毒的接種
　　使用微流體系統(tǒng)(microfluidic chamber system)進行雞胚脊髓背根神經元的原代培養(yǎng)，神經元種植在微流體系統(tǒng)的一個室（胞體室）中，軸突通過細微紋溝伸展至另一個室（軸突室）中。雞胚脊髓背根神經元在胞體室中培養(yǎng)5d后軸突即可通過細微紋管生長至軸突室中。將構建好的重組病毒按一定的MOI接入軸突室或胞體室，在一定的時間點測