偽狂犬病毒多肽抗體的制備及神經(jīng)元體外培養(yǎng)研究.pdf

1、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是豬α皰疹病毒。PRV侵入外周神經(jīng)系統(tǒng)并在其中建立可再激活的感染。病毒通過軸突進(jìn)入細(xì)胞核后（逆向運(yùn)輸），病毒基因一般在細(xì)胞核內(nèi)建立潛伏感染。經(jīng)過數(shù)月甚至數(shù)年之后，潛伏感染可以再次被激活，產(chǎn)生新組裝的病毒顆粒。隨后病毒又運(yùn)輸至外周神經(jīng)系統(tǒng)（順向運(yùn)輸），在外周神經(jīng)系統(tǒng)附近再次感染的上皮細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生感染性的病毒顆粒來感染幼小的宿主。病毒顆粒長(zhǎng)距離的順向和逆向的運(yùn)動(dòng)需要依賴軸突中微管的快速

2、運(yùn)輸機(jī)制。PRV通過受體介導(dǎo)膜融合進(jìn)入軸突，這個(gè)時(shí)候病毒分離為病毒囊膜、糖蛋白、外層被膜蛋白和內(nèi)層被膜蛋白。有一些病毒成分在軸突中是單獨(dú)運(yùn)輸?shù)?，這種運(yùn)輸影響細(xì)胞內(nèi)的潛伏性感染或者增殖性感染。
　　為了能更進(jìn)一步的研究PRV在神經(jīng)細(xì)胞與上皮細(xì)胞之間的方向性傳輸，Ch'ng和Enquist發(fā)明了三室培養(yǎng)系統(tǒng)(triple-chamber system)，這種系統(tǒng)將神經(jīng)元細(xì)胞體與軸突通過物理性的隔離而隔開。隨后又出現(xiàn)了另外一種不同于三室

3、培養(yǎng)系統(tǒng)的微流體系統(tǒng)(microfluidic chamber system)，可以被用做研究α皰疹病毒的蛋白對(duì)病毒在神經(jīng)細(xì)胞軸突運(yùn)輸中的影響。
　　由以上研究背景，本試驗(yàn)通過設(shè)計(jì)多肽并注射到長(zhǎng)耳兔，從而獲得PRV gB、VP16、VP26蛋白的高免血清。分離并培養(yǎng)雞胚脊髓背根神經(jīng)元和新生小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞。在微流體系統(tǒng)(microfluidic chamber system)中體外原代培養(yǎng)雞胚脊髓背根神經(jīng)元，在軸突端或者胞體端接種

4、PRVΔUL21-EGFP重組病毒。在一定時(shí)間內(nèi)收獲軸突端和胞體端的培養(yǎng)基，并分別測(cè)其毒價(jià)。通過分析軸突端和胞體端樣品毒價(jià)從而確定PRV被膜蛋白UL21在軸突順行及逆行運(yùn)輸?shù)淖饔谩Ｖ饕ぷ靼?
　　1.多抗的制備
　　根據(jù)gB、VP16、VP26蛋白的氨基酸序列，找出一段適合的序列設(shè)計(jì)多肽。將設(shè)計(jì)的多肽序列送公司合成。合成好的多肽溶液與弗氏佐劑混合注射至新西蘭長(zhǎng)耳兔。免疫數(shù)次后用ELISA檢測(cè)血清的效價(jià)，達(dá)到要求后，對(duì)長(zhǎng)耳

5、兔進(jìn)行頸動(dòng)脈采血。對(duì)血液進(jìn)行離心并吸取上清，上清即為所需的血清。Western blot檢測(cè)所得到的血清。經(jīng)過檢測(cè)后，這三種血清均含有相應(yīng)蛋白的抗體。
　　2.小鼠海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)
　　選取出生24 h以內(nèi)的新生小鼠，在解剖顯微鏡下分離獲取腦部的海馬組織。用即配的濃度為2mg/ml木瓜蛋白酶消化成單個(gè)的細(xì)胞，接種在六孔板或者小皿中，每三天換液一次，一次更換三分之一，每次換液需提前預(yù)熱培養(yǎng)基。培養(yǎng)10天左右進(jìn)行觀察。通過間

6、接免疫熒光驗(yàn)證所培養(yǎng)的細(xì)胞為小鼠海馬神經(jīng)元。
　　3.微流體系統(tǒng)的建立及重組病毒的接種
　　使用微流體系統(tǒng)(microfluidic chamber system)進(jìn)行雞胚脊髓背根神經(jīng)元的原代培養(yǎng)，神經(jīng)元種植在微流體系統(tǒng)的一個(gè)室（胞體室）中，軸突通過細(xì)微紋溝伸展至另一個(gè)室（軸突室）中。雞胚脊髓背根神經(jīng)元在胞體室中培養(yǎng)5d后軸突即可通過細(xì)微紋管生長(zhǎng)至軸突室中。將構(gòu)建好的重組病毒按一定的MOI接入軸突室或胞體室，在一定的時(shí)間點(diǎn)測(cè)