血管抑素滴眼劑制備及其藥代動力學(xué)的相關(guān)研究.pdf

1、目的：
　　 眼部新生血管性疾病是多種致病因素所致的眼部并發(fā)癥，是損害視力的主要因素之一，包括由于燒傷或移植而引起的角膜血管新生、各種原因引起的脈絡(luò)膜血管新生及糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變。作為一種血漿纖溶酶原的降解片段，血管抑素(angiostantin，As)以其強(qiáng)大的抗血管生成作用受到了人們的極大關(guān)注，自1994年O'Reilly等在荷蘭小鼠血清及尿中發(fā)現(xiàn)至今的近20年中，國內(nèi)外的研究者對其分子結(jié)構(gòu)、抗血管生成的分子機(jī)制及提取方

2、法進(jìn)行了深入而廣泛的探討，并取得了可喜的成果。多年來，伴隨著血管抑素的制備方法日臻完善，國內(nèi)外許多學(xué)者已應(yīng)用血管抑素對角膜、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜等眼部新生血管性疾病的防治工作做了大量的基礎(chǔ)和臨床研究，取得了顯著的效果。而目前國內(nèi)外血管抑素的相關(guān)研究仍停留在動物實驗階段，為了推動血管抑素更早更快的進(jìn)入臨床應(yīng)用，如能對血管抑素滴眼液的制備方法加以優(yōu)化，明確其處方，勢必將極大推動血管抑素在臨床的運(yùn)用。因此，以《中國藥典》2010年最新版相關(guān)內(nèi)容為依

3、據(jù)，在借鑒前人相關(guān)成功經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，本研究擬對血管抑素滴眼液的制備工藝進(jìn)行完善，選擇合適的處方制備重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑，對血管抑素滴眼液的外觀、理化性質(zhì)進(jìn)行考察，運(yùn)用紫外光譜法與Draize法分別對重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑的穩(wěn)定性與刺激性進(jìn)行研究。高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)測定血管抑素滴眼液在玻璃體中的濃度及分布，擬闡明血管

4、抑素滴眼液的藥代動力學(xué)。通過其在眼內(nèi)藥代動力學(xué)指標(biāo)的檢測，確定血管抑素的處方，旨在探索一種可用于臨床治療新生血管性疾病的血管抑素滴眼劑，以期規(guī)?；a(chǎn)，使其適用于臨床工作的需要，造福人類。
　　 方法與過程：
　　 1、血管抑素滴眼劑的制備:配制含0.1％制備量的玻璃酸鈉（滴眼液級）的磷酸鹽緩沖溶液適量，稱取0.01％制備量的苯扎氯銨，溶解于適當(dāng)體積的磷酸鹽緩沖液中，加入玻璃酸鈉溶液，后向其中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的ED

5、TA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉鹽)，充分混勻，補(bǔ)加注射用水至制備量，即得血管抑素滴眼劑賦形劑溶液。將血管抑素滴眼劑賦形劑溶液于超凈工作臺中用0.22μm微孔濾膜除菌過濾得無菌血管抑素滴眼劑賦形劑溶液，量取適當(dāng)體積無菌賦形劑溶液溶解適量重組人Kringle1-3血管抑素原料藥，渦旋震蕩至澄清透明，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01％（即質(zhì)量濃度為100μg/ml）血管抑素滴眼劑若干，封裝，即得重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑。
　　

6、2、血管抑素滴眼液質(zhì)量控制:1）性狀:采用留樣觀察法，觀察血管抑素滴眼液的顏色、澄明度，鑒定是否存在異物。（按照《中國藥典》2010版附錄Ⅸ關(guān)于澄明度及可見異物的檢查法進(jìn)行測定）;2）血管抑素滴眼液pH的檢測:使其pH符合《中國藥典》2010年版有關(guān)滴眼液的規(guī)定。3）血管抑素滴眼液含量的測定:紫外吸收光譜法測定血管抑素滴眼液中血管抑素的含量;4）血管抑素滴眼液的刺激性檢驗:采用新西蘭大白兔作為實驗?zāi)Ｐ?，運(yùn)用Draize試驗進(jìn)行評價;5）

7、血管抑素滴眼液的穩(wěn)定性檢驗:因為常溫下血管抑素理化性質(zhì)不穩(wěn)定，所以將血管抑素滴眼劑樣品分別置于4℃±1℃及-20℃±2℃條件下保存，觀察樣品放置1月、3月及5月的外觀、澄明度及可見異物（沉淀），分別測定放置1、3、5月時樣品于280nm處的吸光度值，計算各時間點(diǎn)吸光度均值，評估重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑樣品第1、3、5月相對于0個月的主藥含量下降值，考察滴眼劑的穩(wěn)定性。
　　 3、血管抑素滴眼液在兔眼內(nèi)組織的分布:

8、健康、無眼疾新西蘭大白兔10只，隨機(jī)分成5組，每組2只4眼，血管抑素滴眼液滴眼給藥后選取0.5、1、2、5、8h5個取材點(diǎn)，各取材點(diǎn)取2只新西蘭大白兔共4眼角膜、房水及玻璃體組織，高效液相色譜法測定給藥0.5、1、2、5、8h后血管抑素滴眼液在角膜、房水及玻璃體中的濃度計分布（重復(fù)此實驗巾的HPLC實驗2次），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并考察精密度及回收率。
　　 4、血管抑素滴眼液眼內(nèi)藥代動力學(xué)的檢測:將兔眼角膜、房水及玻璃體組織中的藥物濃

9、度經(jīng)實用藥物動力學(xué)程序(3p97)進(jìn)行擬合，擬合出符合藥動學(xué)房室模型，并計算相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 1、性狀測定結(jié)果:本實驗制備的血管抑素滴眼液為無色澄清透明液體，按照《中國藥典》2010版附錄Ⅸ關(guān)于澄明度及可見異物的檢查法進(jìn)行測定，經(jīng)檢查血管抑素滴眼劑符合此標(biāo)準(zhǔn)。血管抑素滴眼液pH值為7.35，符合人眼對滴眼劑酸堿度的要求，經(jīng)用數(shù)字貝克曼溫度計測定重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑滲透壓，結(jié)果顯示其

10、與淚液等滲。本制備工藝中0.1％玻璃酸鈉的加入使重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑的黏度維持在合適水平(4.0-5.0 cPa·s)，延長了滴眼劑眼內(nèi)滯留時間，促進(jìn)了滴眼劑在眼內(nèi)的分布。
　　 2、穩(wěn)定性結(jié)果:(1)本實驗制得的重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑不同溫度條件下存放5個月時，其外觀及澄明度不發(fā)生變化，無沉淀產(chǎn)生，理化性質(zhì)穩(wěn)定。(2)在含量考察方面，與0月（對照）吸光度相比，重組人Kringle1-3血管

11、抑素滴眼劑4℃條件下保存5月的吸光度值與0月（對照）相比降低明顯，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05，表2），而-20℃條件下的各時間點(diǎn)吸光度則無顯著性差異(P＞0.05)（表2）;-20℃條件下各時間點(diǎn)吸光度均高于4℃條件下對應(yīng)時間點(diǎn)的吸光度，且-20℃條件下1月、3月、5月含量降低值均低于4℃條件下對應(yīng)時間點(diǎn)的含量降低值，表明重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑在低溫條件下保存穩(wěn)定性較好，且-20℃低溫條件下保存其穩(wěn)定性明顯優(yōu)于4℃條

12、件。
　　 3、刺激性結(jié)果:在藥物安全性評價中，Draize試驗是評價眼刺激性的主要方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血管抑素滴眼劑給藥組與賦形劑組各時間點(diǎn)的Draize評分均＜3分，表明血管抑素滴眼劑對兔眼幾無刺激性。各組在給藥期間兔眼主要表現(xiàn)與給藥前基本相同，即結(jié)膜輕度充血，偶有少量分泌物等。
　　 4、HPLC條件測定:原藥通過與輔料溶劑色譜圖對照發(fā)現(xiàn):3.3min與3.6min左右均有峰出，而原藥在5.625min左右有另一峰出現(xiàn)，

13、而溶劑色譜圖在對應(yīng)的時間點(diǎn)未有峰出現(xiàn)，說明血管抑素原藥的出峰時間大致為5.6min左右。
　　 5、空白玻璃體HPLC圖譜:保留時間為5.844min的時間點(diǎn)有峰出現(xiàn)，對比100上g/ml的血管抑素原藥的色譜圖中血管抑素于5.6min左右出峰，相同的5-20％乙腈(含0.1％TFA)-95-80％水(含0.1％TFA)-35min梯度洗脫條件及相同的210nm檢測波長下，在近似相等的保留時間點(diǎn)均有峰出，證明眼空白玻璃體組織中有內(nèi)

14、源性的血管抑素存在。
　　 6、給藥后各時間點(diǎn)玻璃體HPLC圖譜測定:通過收集滴眼給藥后0.5h、1.0h、2.0h、5.0h及8.0h的玻璃體樣品進(jìn)行HPLC發(fā)現(xiàn):各時間點(diǎn)血管抑素原藥的出峰峰高及峰面積均高于空白玻璃體樣品，給藥0.5h后血管抑素出峰峰高及峰面積分別增加21.76％與20.15％，到給藥1h血管抑素出峰峰高及峰面積增加比例最多，分別達(dá)到153.59％與511.15％，以后各點(diǎn)原藥出峰的峰高及峰面積增加值逐漸減小

15、，到8.0h時間點(diǎn)降為46.97％與208.48％。
　　 結(jié)論
　　 1、制備重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑性狀:本實驗制備的血管抑素滴眼液為無色澄清透明液體，經(jīng)澄明度及可見異物的檢查方法檢測后符合《中國藥典》2010版附錄Ⅸ的對其的要求，血管抑素滴眼液pH值為7.35，符合人眼對滴眼劑酸堿度的要求，且其與淚液等滲，本制備工藝中0.1％玻璃酸鈉的加入使重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑的黏度維持在合適水

16、平（4.0-5.0 cPa·s），延長了滴眼劑眼內(nèi)滯留時間，促進(jìn)了滴眼劑在眼內(nèi)的分布?？芍緦嶒炛苽涞难芤炙胤稀吨袊幍洹?010對滴眼劑的要求。
　　 2、重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑的穩(wěn)定性考察中，通過在制各處方中加入0.1％的EDTA-Na2做為螯合穩(wěn)定劑，血管抑素滴眼劑在-20℃條件下保存5月的吸光度值與0月對照組相比降低不多，含量下降值僅為（13.31±3.93）％，較有效地克服了血管抑素做為糖蛋白本身

17、穩(wěn)定性低的缺點(diǎn)，提高了制劑的穩(wěn)定性。
　　 3、重組人Kringle1-3血管抑素滴眼劑的刺激性考察中，各組在給藥期間兔眼主要表現(xiàn)與給藥前基本相同，即結(jié)膜輕度充血，偶有少量分泌物等，給藥后各時間點(diǎn)的情況根據(jù)Draize評分分值均小于3分，與賦形劑及生理鹽水組分值差別不大，表明本制備方法所得血管抑素滴眼劑對兔眼無刺激性。
　　 4、血管抑素(angiostatin，AS)屬血漿纖溶酶原的內(nèi)部片段，已經(jīng)證實的血管抑素有Kri

18、ngle1-3、Kringle4、Kringle1-4、Kringle1-4.5與Kringle5等5種。本實驗通過改變流動相配比、洗脫條件及檢測波長等方法，摸索出在210nm，5-20％乙腈，95-80％水，35min梯度洗脫條件下可較好地分離重組人Kringle1-3血管抑素，得到較好的峰形，在此條件下重組人Kringle1-3血管抑素的出峰時間約為5.6min左右。取空白玻璃體樣品按摸索出的條件進(jìn)行HPLC發(fā)現(xiàn):在近似相等的保留時

19、間有峰出，且峰形單一，表明在眼部組織中有內(nèi)源性的Kringle1-3血管抑素存在。
　　 5、藥物滴眼后，在不同時間點(diǎn)取材進(jìn)行HPLC，實驗證實各時間點(diǎn)的血管抑素原藥峰高及峰面積均高于空白玻璃體組織，且原藥在滴眼1h后在玻璃體的分布值達(dá)到最大，此后隨著時間的推移Kringle1-3血管抑素在眼內(nèi)的分布開始逐漸降低，到8h時降低幅度最大，峰高僅比空白組織增加46.97％，峰面積增加208.48％。說明滴入眼內(nèi)的血管抑素在眼部1.0