注射用核介素藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf_第1頁(yè)
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1、本文對(duì)注射用核介素藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究,研究工作分為兩部分: 第一部分:建立高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法,測(cè)定犬血漿、大鼠組織(包括心、腦、胃、腎、脾、肺、肝、脂肪、骨骼肌、小腸、睪丸)以及排泄物(包括尿、膽汁、糞便)中白屈菜紅堿的濃度,為注射用核介素的藥代動(dòng)力學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。 研究方法: ①生物樣品的處理:血漿:取血漿樣品0.2ml,加入內(nèi)標(biāo)溶液,旋渦混合2分鐘,加入60μl10%的三氯醋酸溶液混懸1分鐘,離心

2、12000rpm×10分鐘,取上清50μl進(jìn)樣。 組織:取各組織樣品(心、腦、胃、腎、脾、肺、肝、脂肪、骨骼肌、小腸、睪丸)稱重0.5g,加入5ml生理鹽水制成勻漿后離心,取上清液0.2ml,加入內(nèi)標(biāo)溶液,旋渦混合2分鐘,加入60μl10%的三氯醋酸溶液混懸1分鐘,離心12000rpm×10分鐘,取上清50μl進(jìn)樣。 排泄物:取膽汁、尿和糞便預(yù)處理液(0.5g糞便加入生理鹽水5ml制成勻漿,離心取上清)各0.2ml,加入

3、內(nèi)標(biāo)溶液,旋渦混合2分鐘,加入60μl10%的三氯醋酸溶液混懸1分鐘,離心12000rpm×10分鐘,取上清50μl進(jìn)樣。 ②色譜條件:選擇色譜柱AgilentC18分析柱(2.1×50mm5u),調(diào)整流動(dòng)相的組成、配比和流速使白屈菜紅堿色譜峰完全分離。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源(ESI),干燥氣(N2)流速:260L/hr,毛細(xì)管電噴霧電壓:3.0KV,錐孔(cone)電壓:30V,錐孔提取電壓(extractor):5.0V,電

4、離源溫度:115℃,脫溶劑氣溫度:250℃,確定離子檢測(cè)方式,確定最佳選擇離子。 ③標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍:配制系列濃度的白屈菜紅堿對(duì)照品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,以白屈菜紅堿的濃度為橫坐標(biāo),白屈菜紅堿峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 ④回收率及精密度試驗(yàn):取空白血漿分別加入不同濃度的白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成高、中、低三個(gè)濃度的樣品,每個(gè)濃度5份,按“生物樣品處理”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣,記錄峰面積。 ⑤重現(xiàn)性試

5、驗(yàn):取空白血漿加入不同濃度白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成高、中、低三個(gè)濃度的樣品,每個(gè)濃度5份,按“生物樣品處理”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣,考察方法的日內(nèi)、日間重現(xiàn)性。 ⑥靈敏度:以信噪比S/N(3:1)時(shí)相應(yīng)的白屈菜紅堿的濃度為最低檢測(cè)濃度。 ⑦樣品的穩(wěn)定性考察:考察血漿樣品在冷凍、反復(fù)凍融、處理前、后在室溫放置等條件下樣品的穩(wěn)定性。 研究結(jié)果: ①色譜條件的確定:通過(guò)試驗(yàn)確定最佳色譜條件為:C18分析柱(2.1

6、×50mm5u),柱溫:30℃;流速:0.25ml/min;流動(dòng)相:乙腈:水(含0.75%乙酸)=30:70。通過(guò)試驗(yàn)確定采用正離子檢測(cè)方式,選擇性離子為m/z:384.1(白屈菜紅堿[M+H]+),m/z:354.0(白屈菜堿[M+H]+)。 ②標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:犬血漿中白屈菜紅堿在50-6400ng/ml的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)0.9997;大鼠各組織和排泄物中白屈菜紅堿在不同濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)

7、系數(shù)均大于0.9960。 ③回收率及精密度試驗(yàn):在犬血漿和大鼠各組織中白屈菜紅堿的高、中、低三個(gè)濃度的平均回收率和RSD分別為96.0%(2.52),87.5%(2.29),92.3%(5.05);在大鼠各組織和排泄物中,白屈菜紅堿的高、中、低三個(gè)濃度的回收率良好,RSD%小于10% ④重現(xiàn)性試驗(yàn):白屈菜紅堿在血漿中的日內(nèi)和日間重現(xiàn)性良好,高、中、低三個(gè)濃度的日內(nèi)和日間的RSD%分別小于8%和10%。 ⑤靈敏度:

8、犬血漿中的最低檢測(cè)限為5ng/ml,在大鼠的組織及排泄物中的最低檢測(cè)限為0.5ng/ml。 ⑥樣品穩(wěn)定性考察:樣品在室溫放置、冷凍及反復(fù)凍融條件下穩(wěn)定,室溫放置24小時(shí)、冷凍儲(chǔ)藏4周及反復(fù)凍融4次后,變異小于10%,說(shuō)明樣品在上述條件下穩(wěn)定。 研究結(jié)論:本文建立了注射用核介素中白屈菜紅堿在犬血漿、大鼠的組織、膽汁、尿液和糞便中的HPLC-MS測(cè)定方法,方法的專屬性好,靈敏度高,準(zhǔn)確性好;生物樣品的制備過(guò)程簡(jiǎn)便,容易操作.

9、該方法適用于注射用核介素藥代動(dòng)力學(xué)的研究。 第二部分:觀測(cè)注射用核介素在Beagle犬及大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué),為臨床應(yīng)用作參考。 研究方法: 1.犬血漿樣品的處理:Beagle犬9條,隨機(jī)分為3組,小劑量組3只、中劑量組3只、大劑量組3只。三組分別靜脈注射注射用核介素1、3及9mg/kg,于給藥后2、5、10、30、60、180、300、600、1440min分別取血,分離血漿備用。 取0.2ml血漿,按

10、照血漿樣品處理方法處理后直接進(jìn)樣。從血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算犬血漿中白屈菜紅堿的濃度。采用藥代動(dòng)力學(xué)軟件3P87程序,以3條犬各個(gè)相應(yīng)時(shí)間的血藥濃度計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 2.大鼠組織樣品的處理:大鼠10只,每5只大鼠為一組,靜脈注射注射用核介素3mg/kg,分別于用藥后5分鐘及2小時(shí)斷頭處死,放血后取其心、肝、腦、腎、脾、胃、小腸、睪丸、脂肪、骨骼肌和肺,稱重0.5g,加5ml生理鹽水制成勻漿后,3000rpm,離心10分鐘,取上清液0

11、.2ml,按組織樣品的處理方法處理后,取上清液50μl,直接進(jìn)樣。計(jì)算每克組織的藥物含量。 3.大鼠排泄物的處理:大鼠6只,收集空白尿和糞后,靜脈注射注射用核介素3mg/kg,收集給藥后1、5、10、24小時(shí)的尿和糞。取不同時(shí)間的尿液作為尿樣預(yù)處理液。取不同時(shí)間的糞便稱重后,研磨均勻,取0.5g加5ml生理鹽水制成勻漿后,取上清液作為預(yù)處理液。 大鼠10只在乙醚麻醉下進(jìn)行膽管插管,收集空白膽汁,靜脈注射注射用核介素3mg

12、/kg,收集給藥后1、5、10、24小時(shí)的膽汁。取不同時(shí)間的膽汁作為膽汁預(yù)處理液。 分別取膽汁、尿和糞預(yù)處理液0.2ml,按膽汁、尿和糞樣品的處理方法處理后,直接進(jìn)樣測(cè)定白屈菜紅堿含量。計(jì)算不同時(shí)間的排泄量和排泄率及24小時(shí)內(nèi)總排泄量和排泄率。 研究結(jié)果: 1.犬血漿中白屈菜紅堿的濃度:給犬靜脈注射注射用核介素后,血中白屈菜紅堿迅速達(dá)峰濃度,消除半衰期平均約為47分鐘,所靜注的三個(gè)劑量組,AUC分別為12.5、5

13、5.6及122.4(mg/L)min,清除率分別為0.086、0.067及0.088L/kg/min。靜注后,白屈菜紅堿的血藥濃度-時(shí)間曲線呈二室模型 2.大鼠組織中白屈菜紅堿的分布:大鼠靜脈注射注射用核介素后,藥物在所測(cè)定的各組織中均有分布,其中以肺臟、腎臟和脾臟分布最多,心臟和小腸分布較少。 3.大鼠體內(nèi)白屈菜紅堿的排泄:大鼠以注射用核介素3mg/kg靜脈注射后24小時(shí),在尿、糞和膽汁中白屈菜紅堿排泄總量分別為注射劑

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