中外豬種胚胎不同發(fā)育時期骨骼肌轉錄組和全基因組甲基化分析.pdf

1、豬是肉類蛋白的主要來源，同時，也可作為研究人類健康問題的重要醫(yī)學模型。骨骼肌是動物體內(nèi)最豐富的組織，因此研究豬骨骼肌的生長發(fā)育對肉質生產(chǎn)科學和人類醫(yī)學都具有重大意義。本研究以生長速度和肉質性狀存在顯著差異的約克夏豬和通城豬作為研究對象，采用RNA-seq技術，探索了妊娠期40，55，63，70和90天兩豬種胚胎背最長肌差異表達基因不同的時序性表達規(guī)律，推測了兩豬種間肌纖維發(fā)育差異的時間拐點，在此基礎上探究中外豬種在妊娠時期胚胎骨骼肌發(fā)育

2、的分子調(diào)控機理;使用全基因組重亞硫酸鹽測序(WGBS)技術，檢測了妊娠期55天兩豬種胚胎背最長肌的差異甲基化圖譜，分析了兩豬種差異DNA甲基化對肌纖維發(fā)育的調(diào)控;并對轉錄組測序數(shù)據(jù)和全基因組重亞硫酸鹽測序數(shù)據(jù)進行了聯(lián)合分析，分析了DNA甲基化對兩豬種肌纖維發(fā)育過程中差異表達基因的調(diào)控作用，主要研究內(nèi)容和結果如下;
　　1.利用RNA-seq技術獲得了通城豬和約克夏豬妊娠5個時期的胚胎背最長肌的轉錄組表達譜，并利用熒光定量PCR驗證

3、了測序結果的可靠性。在通城豬和約克夏豬分別篩選到1317個和691個差異表達基因(DEG)。使用STEM(Short Time-series Expression Miner)分別對上述通城豬和約克夏豬的發(fā)育依賴的DEGs進行時序性分析，發(fā)現(xiàn)了在兩個豬種中都顯著富集到的表達模式0，39，20和21，表達模式10，11，13和25只在通城豬中顯著富集，表達模式14和15只在約克夏豬中顯著富集。分別對通城豬和約克夏豬的差異基因進行GO和KE

4、GG通路功能注釋及富集分析，結果發(fā)現(xiàn)兩豬種共同表達模式39顯著富集的GO條目中均發(fā)現(xiàn)了多個與肌肉生長發(fā)育相關的GO條目;共同表達模式0顯著富集的GO條目中均發(fā)現(xiàn)了多個與細胞周期相關的GO條目。通路富集分析結果顯示，通城豬和約克夏豬差異表達基因富集的前10條通路中有8條是兩豬種共同富集到的，但富集程度不同。這些結果說明妊娠時期胚胎的背最長肌的發(fā)育機制在兩豬種中有相似之處，又存在一定的差異。
　　2.對兩個豬種分別在5個時期的基因表達

5、進行差異比較分析，總共獲得了1677個差異表達基因。5個比較組中，妊娠55天的差異表達基因最多。對兩個豬種間的差異基因進行GO和KEGG通路功能注釋及富集分析，發(fā)現(xiàn)黏著斑(Focal adhesion)，細胞外基質受體互作(ECM-receptor interaction)，氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)等8條顯著富集的通路。然后，對兩豬種間差異表達基因進行蛋白互作網(wǎng)絡分析，發(fā)現(xiàn)PTEN,EP300，M

6、YO9A，CDK14，IRS1，PPP1CC和一些核糖體蛋白基因可能對揭示兩豬種胚胎肌肉發(fā)育差異有重要作用。
　　3.通過ASprofile軟件分析，發(fā)現(xiàn)第一個外顯子可變剪切(TSS)和最后一個外顯子可變剪切(TTS)事件是兩豬種中最主要的可變剪切類型。
　　4.本研究通過WGBS技術構建了通城豬和約克夏豬在妊娠55天時胚胎背最長肌全基因組DNA甲基化圖譜，并揭示了其DNA甲基化特征;CG雙核苷酸甲基化是兩豬種基因組DNA甲

7、基化的主要方式，只有極少部分DNA甲基化發(fā)生在CHH和CHG序列上;不同功能元件的甲基化水平分析中，CG位點甲基化水平在內(nèi)含子和3，UTR中的DNA甲基化水平較高，而非CG位點甲基化水平在CGI區(qū)域最高。
　　5.通過WGBS技術，通城豬和約克夏豬之間獲得了211822個差異甲基化區(qū)域(DMR)，涉及到了12261個差異甲基化基因(DMG)，其中在通城豬中差異高甲基化的有36582個DMR，涉及到DMG個數(shù)為5301;在約克夏豬中

8、差異高甲基化的DMR為175240個，涉及到DMG為11746個。對兩豬種的DMGs進行GO和KEGG通路功能注釋和富集分析，發(fā)現(xiàn)在CG、CHG、GHH三種不同序列環(huán)境下的DMGs都顯著富集到多個GO條目;KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)非CG序列環(huán)境下的DMGs均顯著富集到多條通路，而CG序列環(huán)境下的DMGs只顯著富集到磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)(Phosphatidyhnositol signaling system)。通過WGBS技術，鑒定到啟動

9、子區(qū)域的DMR為5946個，涉及到DMG為4578個。對啟動子區(qū)DMGs進行GO和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)只有CHH序列背景下的DMGs顯著富集到了GO條目，但是在三種序列背景下的DMGs主要富集到的GO條目中有一些與肌肉發(fā)育相關GO條目;在三種序列背景下的DMGs都沒有顯著富集到通路，但主要富集的通路中都有核糖體(Ribosome)，這表明核糖體通路中基因啟動子甲基化可能會調(diào)控肌肉的發(fā)育。
　　6.對轉錄組測序數(shù)據(jù)與全基因組甲

10、基化測序數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，通過在整體水平上分析DNA甲基化水平與基因表達水平的相關性，發(fā)現(xiàn)兩豬種在基因轉錄起始位點上游2kb及基因本體靠近轉錄起始位點區(qū)域中DNA甲基化水平與基因表達水平呈負相關;基因本體靠近轉錄終止位點區(qū)域中DNA甲基化水平與基因表達水平呈正相關。檢測到同時是DMG又是DEG的基因個數(shù)616個，對其進行通路富集分析發(fā)現(xiàn)，主要富集的通路中黏著斑，Wnt信號通路(Wnt signahng pathway)，凋亡(Apopt

11、osis-multiple species)，細胞外基質受體相互作用和TGF-beta信號通路（TGF-beta signahng pathway）在肌肉生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。
　　7.構建候選基因真核表達載體pcDNA3.1(+)-RPL6和pcDNA3.1(+)-TPPP3;合成RPL6和TPPP3基因的干涉片段并篩選到干涉效率最佳的干涉片段。使用免疫熒光技術，檢測干涉RPL6和TPPP3基因表達后，肌管形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)兩

12、個干涉組的肌管數(shù)目都明顯低于對照組，且RPL6干涉組的肌管明顯變粗。使用流式細胞術，檢測干涉RPL6和TPPP3基因表達后，對C2C12細胞周期進程的影響，發(fā)現(xiàn)RPL6基因參與了細胞周期的調(diào)節(jié)，干涉RPL6后會使滯留于G1期的細胞比例顯著高于對照組，滯留于S期和G2期的細胞比例顯著低于對照組;發(fā)現(xiàn)干涉TPPP3后，細胞周期各階段的細胞比例與對照組相比皆無明顯差異。通過免疫熒光技術鑒定到超表達基因RPL6可以增加細胞中增殖細胞核抗原(PC