酸性多糖甲基化分析方法的改進(jìn).pdf

1、酸性多糖中羧基和硫酸根等酸性基團(tuán)的存在,影響了其在甲基化溶劑中的溶解,致使甲基化程度往往較低,且糖醛酸中羧基的存在導(dǎo)致酸性多糖不易氣化和水解,限制了其應(yīng)用氣相-質(zhì)譜連用(GC-MS)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,制約了甲基化方法在酸性多糖中的應(yīng)用。本文對(duì)甲基化分析過(guò)程中出現(xiàn)的酸性多糖不易在甲基化試劑中溶解和硫酸根位置不易確定等問(wèn)題進(jìn)行了研究,以含有糖醛酸和硫酸根的酸性多糖標(biāo)準(zhǔn)品硫酸軟骨素(CS)為原料,對(duì)含有糖醛酸的酸性多糖還原的條件進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳

2、的糖醛酸還原條件;對(duì)含有硫酸根的酸性多糖的脫硫方法和其在甲基化試劑中的溶解性等問(wèn)題進(jìn)行了探討,對(duì)比研究確定最佳的酸性多糖甲基化條件,為酸性多糖的結(jié)構(gòu)分析奠定基礎(chǔ)。
　　首先以 CS為研究對(duì)象,對(duì)糖醛酸羧基還原的方法進(jìn)行改良。比較了鈉型和氫型 CS樣品分別在不同緩沖液體系、控制pH值的條件下,還原率的高低。結(jié)果顯示,氫型 CS在改良后的75％四氫呋喃-0.1 mol/L2-嗎啉乙磺酸(THF-MES)的緩沖液中,pH4.75和50℃

3、的條件下,采用碳二亞胺-硼氫化鈉(EDC-NaBH4)法還原,糖醛酸還原率高達(dá)98%以上,明顯高于鈉型。比較了不同檢測(cè)方法測(cè)定糖醛酸還原率的優(yōu)劣,結(jié)果顯示高效液相色譜(HPLC)法快捷方便,結(jié)果準(zhǔn)確,是一種理想的糖醛酸還原率檢測(cè)方法。將該方法應(yīng)用于不同結(jié)構(gòu)的酸性多糖糖醛酸還原中,表明該方法具有普適性,不僅適用于CS類,同樣適應(yīng)于透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid)和肝素(Heparin)中糖醛酸還原,也適用于海洋來(lái)源的聚甘露糖醛酸

4、(Polymannuronic Acid)及褐藻糖膠(Fucoidan)中糖醛酸的還原,為不同酸性多糖結(jié)構(gòu)分析,尤其甲基化分析中確定多糖連接方式提供了前提。
　　對(duì)酸性多糖甲基化分析中樣品溶解性差和脫硫不完全等問(wèn)題進(jìn)行探討。通過(guò)將含硫酸根的 CS與不同堿成鹽進(jìn)行甲基化,發(fā)現(xiàn)將 CS與三乙胺成鹽能極大提高其在甲基化試劑中的溶解、提高甲基化產(chǎn)率,全甲基化產(chǎn)率可達(dá)40%。通過(guò)比較CS通過(guò)PMA法和甲醇-DMSO法進(jìn)行脫硫,發(fā)現(xiàn)采用PMA

5、法脫硫后硫酸根含量低、分子降解程度較低,是一種比較理想的脫硫方法。通過(guò)將CS及其他酸性多糖經(jīng)過(guò)糖醛酸還原和 PMA脫硫以后,GC- MS結(jié)果顯示樣品離子響應(yīng)明顯提高,說(shuō)明此方法適于含有糖醛酸和硫酸根酸性基團(tuán)的酸性多糖甲基化,利于進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)研究。且首次發(fā)現(xiàn)多硫酸根樣品甲基化后全甲基化樣品會(huì)較多溶于水層,對(duì)水層與氯仿層樣品同時(shí)進(jìn)行GC-MS對(duì)比分析,可得到較準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)信息。
　　本文利用所建立的方法,通過(guò)對(duì)不同結(jié)構(gòu)的含有糖醛酸的酸性