豬克隆胚胎體外發(fā)育過程中的凋亡與DNA甲基化分析.pdf

1、動物克隆技術(shù)應用目前所遭遇的瓶頸主要體現(xiàn)在技術(shù)效率總體上偏低，早期胚胎死亡率高、妊娠率低，胎兒或克隆動物畸形率高；克隆技術(shù)的進一步突破有賴于對存在問題本質(zhì)的探討。豬體細胞核移植(SCNT)在加速品種改良、建立動物疾病模型等方面具有廣泛的應用前景，在異種器官移植、轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)方面等也有巨大的應用潛力。雖然SCNT技術(shù)已在包括豬在內(nèi)的多種動物上獲得克隆后代，但動物克隆生產(chǎn)的總體效率仍然很低，而豬SCNT的效率尤為低下，嚴重制約了該技術(shù)的進

2、一步發(fā)展與應用。要完善豬體細胞克隆技術(shù)程序，有必要對克隆胚胎發(fā)育過程中所存在的問題進行分析。迄今為止，人們對于克隆胚胎體外發(fā)育過程中的細胞凋亡規(guī)律，克隆重構(gòu)胚表觀遺傳重編程機制等仍知之甚少。本試驗以豬體外成熟卵母細胞為材料，系統(tǒng)研究豬體細胞克隆胚胎體外生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)；在優(yōu)化豬克隆胚胎體外生產(chǎn)程序的基礎(chǔ)上，對克隆胚胎體外發(fā)育過程中的細胞凋亡及DNA甲基化水平的變化規(guī)律進行實驗探討，以期了解豬克隆胚胎在體外發(fā)育與凋亡、DNA甲基化水平變化等方

3、面的內(nèi)在聯(lián)系，為進一步完善豬體細胞克隆技術(shù)體系，提高豬克隆胚胎體外生產(chǎn)效率提供參考依據(jù)。本研究共包括以下6個部分：
　　 試驗一、豬受體卵母細胞的體外成熟與去核本試驗以屠宰場采集的豬卵巢為研究對象，系統(tǒng)比較體外成熟培養(yǎng)液、成熟時間及卵巢生理狀態(tài)等對豬受體卵母細胞體外成熟與去核的影響，旨在優(yōu)化豬卵母細胞采集及其體外成熟培養(yǎng)體系，為進一步研究豬體細胞核移植提供優(yōu)質(zhì)的受體卵母細胞。用抽吸法采集2～5 mm卵泡的卵丘-卵母細胞復合體(C

4、OC)，隨機分為3組，比較3種成熟培養(yǎng)液對豬受體卵母細胞體外成熟的影響。結(jié)果表明10％新生牛血清(NCS)TCM199與NCSU23(BSA free)組的第一極體(pbⅠ)排出率均顯著高于0.1％聚乙烯醇(PVA)TCM199組(79.7％和77.0％對60.2％，P<0.05)；將COC隨機分為3組，采用10％NCSTCM199作成熟培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)42 h、44 h和46 h，Hoechst33342熒光染色鑒定表明，隨著體外成熟

5、時間的延長，pbⅠ與卵母細胞核位置的偏離率逐漸增加，而去核率則逐漸降低，pbⅠ的偏離率與去核率之間呈負相關(guān)，體外成熟培養(yǎng)44 h，既能獲得較高的pbⅠ排出率(80.3％)，又可保障理想的去核率(82.5％)。分別從卵泡期與黃體期卵巢上收集COC，比較卵巢生理狀態(tài)對卵母細胞體外成熟的影響，結(jié)果顯示卵泡期卵巢與黃體期卵巢組間的pbⅠ排出率無顯著差異(80.7％對77.9％，P>0.05)，但在去核率上卵泡期卵巢組顯著高于黃體期卵巢組(82.

6、5％對72.5％，P<0.05)。本實驗結(jié)果表明采集卵巢卵泡期COC，以10％NCS TCM199體外成熟培養(yǎng)豬卵母細胞44 h，可獲得理想的卵母細胞成熟率和去核率。
　　 試驗二、不同來源核供體細胞對豬克隆重構(gòu)胚發(fā)育的影響本實驗通過分離培養(yǎng)4種不同來源的豬核供體細胞，即豬胎兒成纖維細胞(pFF)、卵丘細胞(pCC)、顆粒細胞(pGC)及耳成纖維細胞(pEF)，研究比較其生物學特性及對克隆胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果表明，采用組織塊法分

7、離培養(yǎng)pFF與pEF，所形成細胞單層的時間分別為6～7 d和9～10 d，采用懸浮細胞接種法培養(yǎng)的pCC與pGC形成單層的時間分別為5～6 d和3～4d；生長曲線與核型分析表明，本實驗所分離的4種豬體細胞在前5代，其體外生長特性均能符合體細胞體外生長的一般規(guī)律，染色體倍性正常，可作為核移植的供體細胞使用；選用第3代pFF、pCC、pGC及pEF細胞分別進行核移植，比較不同類型細胞對豬體細胞核移植效率的影響，結(jié)果顯示，以豬pCC為核供體所

8、構(gòu)建的克隆胚囊胚發(fā)育率顯著高于其他3組(P<0.05)。本實驗表明，所分離的4種核供體細胞在前5代具有正常的體外生長特性，但以卵丘細胞為核供體更有利于克隆胚胎的發(fā)育。
　　 試驗三、豬體細胞克隆胚胎的體外生產(chǎn)本試驗以豬卵丘細胞為核供體構(gòu)建克隆重構(gòu)胚，研究電融合/電激活參數(shù)和體外培養(yǎng)體系對豬克隆胚胎體外發(fā)育的影響，旨在優(yōu)化體細胞核移植程序，提高豬克隆胚胎體外生產(chǎn)效率。將重構(gòu)胚隨機分組，分別施以不同電場強度(1.0～2.0 kV/c

9、m)、脈沖寬度(20～120μs)和脈沖次數(shù)(1～3 DC)，結(jié)果表明選用1.5 kV/cm、80μs和1 DC的參數(shù)組合，對豬核移植重構(gòu)胚進行電融合和電激活，獲得最高的囊胚發(fā)育率。在體外培養(yǎng)72 h后，半量換液并未改善克隆胚的發(fā)育，但添加10％胎牛血清(FBS)可顯著提高克隆胚囊胚發(fā)育率(15.1％對10.3％，P<0.05)；采用豬卵泡顆粒細胞(pGC)共培養(yǎng)體系未能顯著提高克隆胚發(fā)育率(P>0.05)，但采用經(jīng)10μg/mL絲裂霉

10、素滅活的卵丘細胞(pCC)單層共培養(yǎng)可顯著提高克隆胚囊胚發(fā)育率(26.6％對13.O％，P<0.05)；與體外受精胚胎相比，克隆胚的卵裂率沒有顯著差異，但其囊胚發(fā)育能力仍然較低(24.6％對29.8％，P>0.05)。本實驗表明采用1.5 kV/cm、80μs和1 DC的參數(shù)組合進行電融合/電激活后，與絲裂霉素滅活的pCC單層共培養(yǎng)，并在體外培養(yǎng)72 h后添加10％FBS可以顯著提高克隆胚的體外發(fā)育能力。
　　 試驗四、豬克隆胚

11、胎的凋亡分析本試驗旨在研究豬SCNT胚胎體外發(fā)育過程中的凋亡規(guī)律，探討細胞凋亡與克隆胚胎發(fā)育的關(guān)系。將體外成熟培養(yǎng)的MⅡ期卵母細胞隨機分為2組，分別進行IVF與SCNT處理。以體外受精(in vitro fertilization，IVF)胚胎為對照，采用彗星試驗(Comet assay)研究比較豬SCNT胚胎的體外發(fā)育與凋亡變化規(guī)律。結(jié)果表明，豬SCNT胚胎的卵裂率與IVF組無顯著差異，而囊胚發(fā)育率顯著低于IVF組；但與滅活的pCC單

12、層共培養(yǎng)，豬SCNT胚胎的囊胚發(fā)育率顯著升高(26.6％對13.0％P<0.05)。彗星試驗表明SCNT與IVF胚胎的凋亡率均隨胚胎發(fā)育而呈不斷增加的趨勢，并在2-細胞期(8.3％對2.1％，P<0.05)與囊胚期(46.2％對26.1％，P<0.05)，SCNT組胚胎的凋亡率顯著高于IVF組；但與滅活的pCC單層共培養(yǎng)明顯降低了SCNT胚胎囊胚期細胞凋亡率(27.6％對46.2％，P<0.05)。本研究表明豬克隆胚胎生產(chǎn)效率低可能與細

13、胞凋亡有關(guān)，但與滅活的pCC單層共培養(yǎng)可明顯抑制細胞凋亡，促進克隆胚胎的發(fā)育(P<0.05)。彗星試驗具有簡便、快速、靈敏以及樣品需求量少等優(yōu)點，可以用于檢測豬早期胚胎細胞凋亡。
　　 試驗五、豬克隆胚胎體外發(fā)育過程中凋亡相關(guān)基因的表達本試驗旨在研究豬SCNT胚胎體外發(fā)育與凋亡過程中凋亡相關(guān)基因的表達模式，分析豬SCNT胚胎凋亡的分子調(diào)控機制。以豬體外受精(IVF)胚胎為對照，采用Real-time RT PCR技術(shù)對豬SCNT

14、胚胎不同發(fā)育階段的凋亡相關(guān)基因Fas/FasL及Bcl-2 mRNA水平進行相對定量分析。結(jié)果表明，在8-細胞期以前，豬IVF與SCNT胚胎的Fas、FasL mRNA一直維持低水平表達，8-細胞以后Fas、FasL mRNA水平均有所升高，且SCNT胚胎升高最為明顯，特別是在囊胚期，F(xiàn)as、FasL mRNA表達量均顯著高于IVF組(P<0.05)。隨著胚胎的不斷發(fā)育，IVF與SCNT胚胎的Bcl-2 mRNA表達量均逐漸下降，至囊胚

15、期SCNT胚胎Bcl-2 mRNA水平顯著低于IVF組(P<0.05)；與pCC共培養(yǎng)使克隆胚胎囊胚期的Fas/FasL mRNA表達明顯下降，并顯著提高Bcl-2 mRNA表達水平。本試驗表明，豬克隆胚胎體外生產(chǎn)效率低下與胚胎的異常凋亡相關(guān)，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)參與了克隆囊胚階段的凋亡調(diào)控；與豬卵丘細胞共培養(yǎng)可通過影響凋亡相關(guān)基因的表達，進而抑制豬SCNT胚胎的凋亡。
　　 試驗六、豬克隆胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化相關(guān)基因的表

16、達為探討豬克隆胚胎體外發(fā)育過程中DNA甲基化相關(guān)基因表達的變化規(guī)律，采用Real-time RT PCR技術(shù)對不同發(fā)育階段的豬克隆胚胎DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1、Dnmt3a mRNA相對表達量進行測定分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCNT與IVF胚胎發(fā)育過程中Dnmt1 mRNA表達具有相似的降低趨勢，但IVF胚胎在8-細胞以前的表達量下降更為劇烈，且在4-至8-細胞期的表達量顯著低于SCNT胚胎組(P<0.05)。Dnmt3a mRNA在SCNT

17、與IVF胚胎2-至4-細胞階段均維持較低的表達水平，但從8-細胞期開始，Dnmt3a mRNA表達水平開始逐漸上升，且SCNT胚胎組增加程度更為劇烈，囊胚期的SXNT組Dnmt3a mRNA表達水平均顯著高于IVF組(P<0.05)。此外，pCC單層共培養(yǎng)時，克隆胚胎Dnmt1和Dnmt3a mRNA表達并未發(fā)生明顯的變化。本試驗表明，豬克隆胚胎體外發(fā)育率低可能與特定發(fā)育時期DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)基因高表達所導致的供體核不完全重