豬支原體肺炎活疫苗RM48株氣霧免疫技術(shù)的研究.pdf

1、豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)即豬的喘氣病，由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，MHP)引起的一種常見(jiàn)的慢性呼吸道疾病，一旦感染MHP后常常會(huì)繼發(fā)感染別的呼吸道疾病很難被治愈，給養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)于該病的根治理論上是完全可行的，但是在實(shí)際的操作過(guò)程中基本無(wú)法實(shí)現(xiàn)。目前對(duì)該病的控制措施最有效的方法是接種疫苗。目前我國(guó)市面上的疫苗主要是滅活苗和弱毒

2、苗，滅活苗多為進(jìn)口疫苗價(jià)格高昂成為了其在各大豬場(chǎng)部署的障礙，而我國(guó)國(guó)產(chǎn)的弱毒疫苗多為肺內(nèi)注射，操作復(fù)雜且不被大多數(shù)養(yǎng)殖戶(hù)所接受同樣影響了其在個(gè)大養(yǎng)殖場(chǎng)的部署。鑒于此，本課題以豬肺炎支原體RM48疫苗株為研究對(duì)象，并對(duì)弱毒苗的佐劑進(jìn)行篩選，旨在驗(yàn)證MPS的氣霧免疫的可行性以及篩選出合適的疫苗佐劑。具體的實(shí)驗(yàn)分為以下的三個(gè)步驟實(shí)施：
　　1．霧化對(duì)RM48疫苗株的影響及霧化器的篩選
　　分別使用購(gòu)買(mǎi)的超聲霧化器和壓縮空氣霧化器在

3、無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室中對(duì) RM48疫苗株進(jìn)行霧化，無(wú)菌保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肅CU法對(duì)收集到的疫苗進(jìn)行支原體計(jì)數(shù)，并設(shè)立未霧化對(duì)照組。在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12d后最后一瓶不再變色。結(jié)果顯示超聲和壓縮空氣霧化組的活菌數(shù)均和對(duì)照組無(wú)差別，說(shuō)明霧化對(duì)RM48疫苗株并無(wú)太大損害。
　　通過(guò)比對(duì)兩種霧化器的霧化速度、霧化后氣霧的粒徑以及噴射距離后選擇了壓縮空氣霧化器作為噴霧免疫的霧化器。
　　2．利用家兔模型評(píng)價(jià)各種佐劑對(duì)豬支原體肺炎活疫苗的免疫增強(qiáng)作用

4、以及活疫苗噴霧免疫的可行性
　　佐劑的初步篩選及用量確定：將事先準(zhǔn)備并配制好的黃芪多糖、天蠶素、板藍(lán)根+烏梅黃酮、CPG、天冬提取物佐劑按一定的濃度與RM48活疫苗混合稀釋?zhuān)謩e室溫下放置30min、1h和2h進(jìn)行CCU活性計(jì)數(shù)看佐劑對(duì)活疫苗的毒性。結(jié)果顯示板藍(lán)根+烏梅黃酮對(duì)疫苗的活性影響較大棄用。其余佐劑對(duì)活疫苗基本無(wú)毒性作用。天蠶素和CPG的用量由實(shí)驗(yàn)室提供分別為20μg/頭和10μg/頭。通過(guò)活性計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)確定黃芪多糖和天冬提

5、取物的用量為1mg/頭和5mg/頭。
　　家兔免疫后體內(nèi)疫苗株的PCR檢測(cè)：在免疫后第7d和14d每組分別剖殺一只兔子取肺臟、脾臟和肝。研磨處理后提取DNA然后進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體內(nèi)疫苗株分布。結(jié)果顯示在第7d肺內(nèi)的PCR結(jié)果為陽(yáng)性，其他組織均為陰性，第14d只有一組的肺呈弱陽(yáng)性。
　　免疫后體內(nèi)細(xì)胞因子及抗體的檢測(cè)：于首次免疫后第7d、14d、21、28d分別取兔鼻拭子和血液，處理后用事先買(mǎi)好的試劑盒分別測(cè)定IL-4、IF

6、N-γ和SIgA，結(jié)果顯示各佐劑組均能誘導(dǎo)兔子產(chǎn)生高水平的細(xì)胞免疫、體液免疫以及黏膜免疫水平，其中尤其以CPG佐劑組最高。
　　3．用噴霧的方式對(duì)仔豬進(jìn)行免疫
　　在本動(dòng)物試驗(yàn)研究中，實(shí)驗(yàn)分為天冬提取物噴霧免疫組、CPG噴霧免疫組、黃芪多糖噴霧免疫組、天冬提取物噴霧免疫組、肺內(nèi)注射無(wú)佐劑組、無(wú)佐劑噴霧免疫組和對(duì)照組。分別在免疫前測(cè)定每組四只初生仔豬的體重，并在免疫后7d、14d、21d和28d采鼻拭子并測(cè)體重。用試劑盒測(cè)定鼻