抗菌肽Bactenecin7在乳酸乳球菌中的分泌表達(dá)及其同源重組載體的構(gòu)建.pdf

1、腸道細(xì)菌感染為常見(jiàn)的消化道疾病。致病菌大多是革蘭陰性菌，通常引起腹瀉、腹痛、發(fā)熱甚至引起全身性感染。目前針對(duì)腸道細(xì)菌感染主要是使用抗生素進(jìn)行抗菌治療。但隨著抗生素的不合理應(yīng)用、濫用以及口服抗菌藥物應(yīng)用的增多，消化道致病菌的耐藥性問(wèn)題正變得日益嚴(yán)重。對(duì)于耐藥性細(xì)菌腸道感染的治療，新型抗菌藥物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用變得尤為重要。 抗菌肽（antimicrobial peptide）是一類具有抗菌活性的多肽，在生物體的天然免疫中起著重要作用?？?/p>

2、菌肽具有廣譜、高效抗菌活性，與其他抗菌藥物多無(wú)交叉耐藥性，而且不易誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Bactenecin7（Bac7）對(duì)革蘭陰性菌具有高效抗菌活性，除直接殺菌作用外，Bac7還有中和內(nèi)毒素、抗炎、免疫誘導(dǎo)、組織修復(fù)等功能。顯然抗菌肽Bac7在腸道細(xì)菌感染治療中具有眾多優(yōu)勢(shì)，有望成為治療革蘭陰性細(xì)菌引起的腸道感染的新一代抗菌藥物。 研究目的: 構(gòu)建攜抗菌肽Bac7基因的表達(dá)載體并在乳酸乳球菌中高效分泌表達(dá)

3、，為抗菌肽Bac7治療腸道革蘭陰性菌感染的合理安全應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)構(gòu)建攜抗菌肽Bac7基因的乳酸乳球菌MG1363（L。Lactis MG1363）的同源重組載體，為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)抗菌肽Bac7基因乳酸乳球菌治療腸道感染奠定基礎(chǔ)。 研究方法: 1.抗菌肽Bac7分泌表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)乳酸乳球菌對(duì)密碼子的偏愛(ài)性和Genbank中Bac7蛋白序列，設(shè)計(jì)并化學(xué)合成Bac7基因序列以及分泌信號(hào)肽（SPUSP）序列和增

4、強(qiáng)表達(dá)序列（Leisstcda）的拼接引物，采用重疊延伸PCR方法，拼接合成Bac7基因及其相關(guān)調(diào)控元件序列，并將其克隆至載體pMG36e中構(gòu)建重組載體pMG36e-Bac7。 2.抗菌肽Bac7抗血清的制備：利用軟件DNASTAR預(yù)測(cè)抗菌肽Bac7的抗原決定簇，采用化學(xué)合成法合成其抗原決定簇序列（N-端20個(gè)氨基酸）。將合成的多肽與鑰孔血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶聯(lián)、純化后免疫家兔。

5、制備的抗血清經(jīng)鹽析純化后用SDS-PAGE和ELISA方法進(jìn)行抗體的純度和滴度測(cè)定。 3.L.lactis MG1363的電擊轉(zhuǎn)化：通過(guò)試驗(yàn)確定最適電轉(zhuǎn)化條件，并在此條件下將重組質(zhì)粒pMG36e-Bac7電擊轉(zhuǎn)化至L.lactis MG1363中。挑取單菌落增菌后提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，進(jìn)一步將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒做雙酶切鑒定。 4.抗菌肽Bac7基因在L.lactis MG1363中的分泌、表達(dá)情況分

6、析：采用RT-PCR方法檢測(cè)Bac7基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。通過(guò)Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析Bac7基因在L.lactis MG1363中的表達(dá)、分泌情況。 5.表達(dá)產(chǎn)物生物活性的初步檢測(cè)：采用超濾離心法將L.lactisMG1363培養(yǎng)液上清中表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行濃縮。瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)濃縮上清中抗菌肽Bac7對(duì)大腸桿菌和陰溝腸桿菌的抑菌活性。 6.攜Bac7基因的L.lactis MG1363同源

7、重組載體的構(gòu)建：根據(jù)L.lactis MG1363基因組中的胸腺嘧啶合成酶基因（thymidylate synthase gene，ThyA）序列設(shè)計(jì)引物，以L.lactis MG1363基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增ThyA基因起始密碼上游及下游各約1000bp左右的堿基序列，并將其依次克隆至載體pMUTIN4中，再將Bac7基因插入載體多克隆位點(diǎn)構(gòu)建出同源重組載體pThyA-Bac7。 研究結(jié)果: 1.經(jīng)重疊延伸PC

8、R方法成功拼接合成Bac7及其相關(guān)調(diào)控元件序列并將其克隆至載體pMG36e，構(gòu)建了重組載體pMG36e-Bac7，經(jīng)雙酶切鑒定并進(jìn)一步測(cè)序確證，結(jié)果顯示目的基因與設(shè)計(jì)序列完全一致。 2.成功制備了兔抗Bac7多克隆抗體，抗體經(jīng)鹽析純化后進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)果顯示制備的抗體純度較高。進(jìn)一步用ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)，效價(jià)達(dá)1：10000。 3.初步確定了L.lactis MG1363最適電轉(zhuǎn)化參數(shù)：電壓10kV/

9、cm，電阻200Ω，電容25μF，電擊時(shí)間5.0ms。通過(guò)電擊成功地將重組質(zhì)粒導(dǎo)入L.lactis MG1363中。RT-PCR、Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，抗菌肽Bac7可有效表達(dá)，并分泌于L.lactis MG1363培養(yǎng)液上清中。 4.瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)結(jié)果證明，表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Bac7在體外能有效抑制大腸桿菌和陰溝腸桿菌的生長(zhǎng)。 5.成功構(gòu)建了L.lactis MG1363同源重組載體pThy-Bac7，經(jīng)雙

10、酶切鑒定和進(jìn)一步測(cè)序鑒定，結(jié)果與預(yù)期完全一致。 研究結(jié)論: 1.攜重組質(zhì)粒pMG36e-Bac7的L.lactis MG1363能有效表達(dá)、分泌抗菌肽Bac7，表達(dá)分泌于培養(yǎng)液上清的抗菌肽Bac7在體外能有效殺滅大腸桿菌和陰溝腸桿菌。 2.成功制備了抗菌肽Bac7多克隆抗體。 3.成功構(gòu)建了攜抗菌肽Bac7基因的L.lactis MG1363同源重組載體pThy-Bac7，為實(shí)現(xiàn)Bac7基因在乳酸菌中的整