玉米冠根和雄穗中microRNA及Argonaute基因表達的研究.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)是一類在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的小RNA分子。大量研究表明，miRNA在調(diào)控植物生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫中起著重要的作用;miRNA行使其調(diào)控功能需與Argonaute(AGO)蛋白形成沉默復(fù)合體(RISC:RNAinduced Scilencing Complex)，指導(dǎo)AGO蛋白作用于靶基因，因此AGO蛋白是miRNA行使功能的重要因子。研究證明，不同的AGO蛋白結(jié)合不同種類的小RNA，在特定的

2、逆境條件和組織發(fā)育時期發(fā)揮作用。本研究針對miRNA在玉米逆境和生長發(fā)育中所扮演的重要角色，利用高通量測序和分子生物學(xué)技術(shù)全基因組解析玉米冠根和雄穗中的miRNA表達，鑒定玉米冠根中淹水脅迫響應(yīng)的miRNA及其靶基因，克隆玉米基因組中編碼AGO蛋白的基因，揭示AGO基因的時空表達模式，探討與雄穗發(fā)育相關(guān)的ZmAGO18a的表達及其調(diào)控分子機理。本研究取得了以下研究結(jié)果:
　　 1.對玉米自交系HZ32和MO17的冠根組織中小RN

3、A進行了Solexa測序，得到了高質(zhì)量的序列結(jié)果。在8個測序文庫中，鑒定到61個成熟小RNAs，其中36個已知的玉米miRNA，25個新的miRNA。miR528在冠根中的表達豐度最高。miR156、miR166、miR167和miR168家族成員在冠根中表達量高，而miR159、miR164、miR167、miR169、miR319和miR396家族在冠根中表達量低。
　　 2.在HZ32和MO17的冠根中，鑒定到26個淹水響

4、應(yīng)的miRNAs，包括19個已知的miRNAs和7個新的miRNAs，大部分miRNAs在兩個自交系中對淹水響應(yīng)的趨勢是一致的。
　　 3.對HZ32和MO17冠根組織的降解組文庫測序，檢測到27個miRNA的98個靶基因，其中大部分為已知miRNA的靶基因，同時，也檢測到了一些miRNA新的靶基因，如miR166的靶基因酪氨酸蛋白激酶，miR390的靶基因無機焦磷酸酶和miR529的靶基因脫水蛋白13。利用QPCR對miR16

5、7e、miR164e/f、 miR172a、miR393a/b和miR528a及其靶基因進行表達分析，證實靶基因的表達與miRNA的表達呈負相關(guān)。同時采用5'-RLM-RACE的方法對靶基因切割位點進行驗證，揭示了zma-miRn03/06直接切割的轉(zhuǎn)錄本分別編碼鋅指蛋白，ran GTPase和K-box轉(zhuǎn)錄因子，zma-miR393b切割TIR1-like基因，zma-miR394a切割F-box基因。綜合miRNAs的表達和降解組數(shù)

6、據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)miR167、miR393和miR172家族成員在調(diào)控玉米冠根發(fā)育及其響應(yīng)淹水脅迫中具有重要作用，建立了miR167、miR393和miR172家族成員介導(dǎo)的基因表達調(diào)控模型。
　　 4.基于B73參考基因組序列，生物信息學(xué)方法鑒定了17個ZmAGO蛋白編碼基因;RACE分析得到了11個基因的全長cDNA;系統(tǒng)進化分析將玉米17個ZmAGO蛋白分為五大類。
　　 5.對ZmAGO蛋白的PIWI結(jié)構(gòu)域氨基酸序列

7、進行多序列比對分析，總結(jié)了PIWI結(jié)構(gòu)域內(nèi)的DDH/H motif類型，發(fā)現(xiàn)ZmAGO1s，ZmAGO2s和ZmAGO10s較為保守。
　　 6.采用半定量RT-PCR和QPCR技術(shù)對17個ZmAGO基因在15個組織器官的表達模式進行了分析，發(fā)現(xiàn)ZmAGO基因在生殖器官中的表達量要遠遠高于在營養(yǎng)器官中的表達量，并發(fā)現(xiàn)ZmAGO18a和ZmAGO5a在減數(shù)分裂時期的玉米雄花穗中表達量高。
　　 7.分析了ZmAGO18基因

8、在不同組織，不同發(fā)育時期的花藥及其上下位小花中的表達，發(fā)現(xiàn)ZmAGO18a基因在減數(shù)分裂時期的花藥中表達量高。mRNA原位雜交和蛋白熒光免疫組化分析證實ZmAGO18a在減數(shù)分裂時期花藥的絨氈層和花粉母細胞中大量表達。
　　 8.利用高通量測序的方法，分離了玉米減數(shù)分裂時期雄穗中的小RNA，鑒定到172個已知miRNA基因?qū)?yīng)27個miRNA家族，20個新的成熟miRNA對應(yīng)30個新MIR基因;并通過RIP-seq技術(shù)，將該時期