玉米授粉過(guò)程中microRNA的表達(dá)分析.pdf

1、授粉是植物生長(zhǎng)發(fā)育中一個(gè)既重要又復(fù)雜的過(guò)程，它需要花柱和花粉的正常發(fā)育以及相互作用，需要多種物質(zhì)的參與和多重基因的調(diào)控。任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，都會(huì)對(duì)正常授粉造成影響。microRNA（miRNA）作為基因沉默的重要組成部分，其作用越來(lái)越受到人們的重視，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們?cè)谥参锏男盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、形態(tài)建成、花器官發(fā)育等重要的過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。但目前對(duì)于miRNA 在植物授粉中的作用還知之甚少。本研究主要以玉米為材料，應(yīng)用miRNA 芯片和高通量測(cè)序技

2、術(shù)，試圖找到在授粉過(guò)程中發(fā)揮作用的miRNA，并對(duì)其作用進(jìn)行初步研究。主要結(jié)果如下：
　　 （1）我們以玉米鄭58 自交系的幼嫩柱頭（Im）、成熟柱頭（MS）、授粉后5min 柱頭（PA5）、授粉后15min 柱頭（PA15）以及未授粉子房（UFO）為材料，通過(guò)miRNA芯片技術(shù)，得到了一系列在初始授粉過(guò)程中差異顯著（FDR控制在5％以?xún)?nèi)，F(xiàn)old change不低于2.0倍）的miRNA。其中，授粉后15min的柱頭與授粉后5

3、min的柱頭相比，表達(dá)差異顯著的miRNA 最多，有126個(gè)。其余的材料中差異顯著的miRNA 比較少。通過(guò)比較不同樣品中miRNA的表達(dá)量差異，我們得到了25個(gè)差異顯著的極可能在授粉過(guò)程中發(fā)揮作用的miRNA，其中大部分為未知的預(yù)測(cè)miRNA，它們的靶基因包括ARF、HD-ZIPⅢ轉(zhuǎn)錄因子、AGO1以及CYP450 單氧化酶的編碼基因等。
　　 （2）分析結(jié)果表明miR167d 可能對(duì)授粉有著重要影響。玉米和擬南芥中的MIR1

4、67D基因，在擬南芥中過(guò)量表達(dá)后都會(huì)造成轉(zhuǎn)基因擬南芥植株矮小、花器官發(fā)育異常、花粉不能萌發(fā)、敗育等表型。
　　 （3）通過(guò)生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)了玉米中三個(gè)新的miRNA，分別為miR3171、miR3176和miR3220。將其序列與Rfam 10.0數(shù)據(jù)庫(kù)中的小RNA 比對(duì)，推測(cè)它不屬于tRNA、siRNA等小RNA。應(yīng)用莖環(huán)式Taqman Real-time quantitative PCR(qRT-PCR）
　　

5、檢測(cè)到了它們的成熟體的表達(dá)，應(yīng)用RLM-RACE 找到了這三個(gè)miRNA的前體，其前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)符合miRNA 前體的判定標(biāo)準(zhǔn)。由此確定這三個(gè)miRNA是玉米中新的miRNA，并且它們屬于同一家族。
　　 （4）選取玉米B73 自交系的成熟花粉（P）、離體萌發(fā)花粉（GP）、成熟柱頭（MS）、授粉后的柱頭（PS）為材料，通過(guò)miRNA 高通量測(cè)序，應(yīng)用生物信息學(xué)方法找到了109個(gè)新的miRNA，它們的靶基因功能多種多樣，能夠編碼甾

6、醇合成酶、核糖體蛋白、亞精胺合成酶、富含亮氨酸的跨膜運(yùn)輸?shù)鞍?、微管蛋白、甲基轉(zhuǎn)移酶、蛋白激酶等。這提示我們，這些新的miRNA 功能非常廣泛，它們可能在玉米的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。
　　 （5）得到miRNA 高通量測(cè)序的結(jié)果后，我們采用chi2 算法進(jìn)行分析（以P value不大于0.01 為顯著差異）。發(fā)現(xiàn)了88個(gè)由花粉管萌發(fā)誘導(dǎo)產(chǎn)生的miRNA，其中64個(gè)為已知的,24 為預(yù)測(cè)的新的miRNA；得到了48個(gè)由授粉誘

7、導(dǎo)產(chǎn)生的miRNA，包括37個(gè)已知的和11個(gè)未知的miRNA，它們的啟動(dòng)子區(qū)域含有多種順式作用元件，其靶基因包括GRF（growth-regulating factor）、GRAS 家族轉(zhuǎn)錄因子、編碼甲酯酶、漆酶的基因等。它們或來(lái)自于花粉，或來(lái)自于柱頭，極可能參與了花粉與柱頭的相互識(shí)別和互相作用。
　　 綜上所述，本研究通過(guò)miRNA芯片技術(shù)，篩選到25個(gè)在玉米授粉過(guò)程中變化顯著的miRNA，并對(duì)其靶基因功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)，其中3個(gè)