microRNA對hERG基因表達影響的研究.pdf

1、背景與目的：惡性室性心律失常是導致心源性猝死( SCD)的主要原因，但因其誘發(fā)因素繁多、發(fā)病機制不詳，難以得到有效的預防及治療。其中臨床常見的獲得性長 Q T綜合征( aLQTS)致尖端扭轉型室性心動過速( TdP)是導致 S C D的重要原因之一。大量研究證實，阻滯 hERG（即 KCNH2）基因所編碼的快速激活延遲整流鉀電流（IKr）通道時，可引起外向鉀電流減少，使心肌細胞復極延長，易產(chǎn)生 TdP。近年來，有研究表明，微小 RNA(

2、miRNA)表達水平異常，可引起離子通道蛋白表達紊亂，導致離子通道失衡，誘發(fā)心律失常。本研究組前期已通過雙熒光素酶基因報告法從最初預測的6個miRNA（miR-134、miR-143、miR-103、miR-147、miR-185、miR-3619）中，初步篩選出4個與hERG基因有相關性（miR-134、miR-143、miR-103、miR-3619）。本實驗旨在進一步驗證所篩選miRNA與hERG基因的相關性，并以 hERG基因為

3、靶點，探討 miRNA對其功能的影響，為aLQTS發(fā)生機制的研究提供新的思路。
　　方法：1.將 WT-hERG轉染至 U2OS細胞中，用濃度為400μg/ml G418篩選出穩(wěn)定表達 WT-hERG的單克隆細胞；2.用miRNA及其相應的反義寡核苷酸序列（AMOs）對 hERG-U2OS細胞模型進行干預；3. RT-PCR檢測 miRNA對 hERG基因相關 mRNA表達的影響，western blot檢測 miRNA對 hER

4、G基因相關蛋白質表達的影響，激光共聚焦檢測 miRNA對 hERG基因相關蛋白質定位的影響。結果：Western blotting結果顯示，用400μg/ml G418篩選出的轉染 WT-hERG的U2OS細胞，可見兩條明顯的蛋白質條帶，分別表示 hERG基因所表達的滯留于內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)的不成熟核心糖基化蛋白（135kD蛋白質條帶）和位于細胞膜上、完全成熟的糖基化蛋白（155kD蛋白質條帶），表明 hERG-U2OS穩(wěn)定表達細胞株構建成功。分

5、子生物學相關實驗結果如下：
　　1. RT-PCR結果顯示：miR-134、miR-143、miR-103、miR-3619過表達可使hERG相關 mRNA相對表達量較對照組下調(diào)；用相應的AMOs拮抗miRNAs，hERG相關 mRNA相對表達量較對照組無明顯變化；miR-147、miR-185作用下 hERG相關 mRNA相對表達量較對照組無明顯改變；
　　2. Western blot結果顯示：miR-134、miR-1

6、43、miR-103、miR-3619過表達可使 hERG相關蛋白質表達較對照組下調(diào)；用相應的AMOs拮抗miRNAs，hERG相關蛋白質表達較對照組無明顯變化；miR-147、miR-185作用下 hERG相關蛋白質表達較對照組無明顯改變；
　　3.激光共聚焦結果顯示：miR-134、143、103、3619過表達可使 hERG-U2OS細胞胞質內(nèi)未成熟蛋白及細胞膜上成熟通道蛋白的表達較對照組均降低，用相應的AMOs沉默 miR