家蠶傳染性軟化病病毒翻譯起始機(jī)制的研究.pdf

1、家蠶軟化病是一類(lèi)嚴(yán)重影響蠶業(yè)生產(chǎn)的病害，家蠶傳染性軟化病病毒(Bombyx mori infectious flacherie virus，BmIFV)作為導(dǎo)致該病的重要病原之一，曾引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。BmIFV是一種正義單鏈小RNA病毒，專(zhuān)一寄生家蠶中腸組織的杯狀細(xì)胞，被歸入小RNA病毒目(Picornavirales)傳染性軟化病毒科(Iflaviridae)傳染性軟化病毒屬（Iflavirus）。
　　 本研究通過(guò)運(yùn)

2、用生物信息學(xué)分析BmIFV結(jié)構(gòu)蛋白前的5'端序列發(fā)現(xiàn):其5'端序列具有多個(gè)同框的起始密碼子AUG（具有相同的終止密碼子）且5'端序列的前端與具有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（Internal ribosome entry site，IRES）功能的榕透翅毒蛾病毒（Perina nuda virus，PnV）的序列結(jié)構(gòu)十分相似，而其后端與小RNA病毒Ⅱ型的IRES結(jié)構(gòu)十分相似。通過(guò)構(gòu)建含有雙熒光蛋白基因和雙熒光素酶基因的兩類(lèi)重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，驗(yàn)

3、證不同長(zhǎng)度的BmIFV5'端序列的IRES功能。結(jié)果證實(shí):BmIFV不同長(zhǎng)度的5'端片段具有不同的IRES活性，其中1-155 nt片段的IRES介導(dǎo)下游外源基因的翻譯活性最低，而1-599nt片段的IRES介導(dǎo)外源蛋白的翻譯活性最高。
　　 利用構(gòu)建的含有雙熒光蛋白的重組桿狀病毒vR-IFV599-G侵染四種鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞系（BmN細(xì)胞系、Sf9細(xì)胞系、Tn細(xì)胞系和SL細(xì)胞系），結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmIFV IRES介導(dǎo)的下游外源基因能

4、夠在BmN、Sf9和Tn細(xì)胞系中表達(dá);SL細(xì)胞系中，BmIFV IRES介導(dǎo)和帽子結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的下游外源基因均未表達(dá)，經(jīng)Dot blotting分析發(fā)現(xiàn)在添加重組病毒vR-IFV599-G的SL細(xì)胞中，未雜交到EGFP的mRNA，由此推測(cè)所構(gòu)建的重組桿狀病毒未侵染SL細(xì)胞或多角體啟動(dòng)子未能在SL細(xì)胞中被激活，導(dǎo)致EGFP的mRNA未轉(zhuǎn)錄。進(jìn)而證實(shí)BmIFV的IRES功能在BmN、Sf9和Tn細(xì)胞系中無(wú)種屬特異性。
　　 構(gòu)建含有雙熒

5、光蛋白的重組桿狀病毒vR-IFV599-G侵染5齡起蠶發(fā)現(xiàn):被重組病毒侵染的家蠶全身都具有紅色和綠色熒光。對(duì)被感染家蠶的4種組織（中腸、絲腺、脂肪體和表皮）進(jìn)行Western blotting分析發(fā)現(xiàn):4種組織中均具有紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白的雜交條帶出現(xiàn)，說(shuō)明BmIFV的IRES介導(dǎo)的下游外源基因的表達(dá)在家蠶中無(wú)組織特異性。這與BmIFV特異性的侵染家蠶中腸組織杯狀細(xì)胞的特性有差異，說(shuō)明BmIFV侵染的特異性與其翻譯的特性無(wú)關(guān)，可能

6、與其侵染受體的特異性或復(fù)制的特異性有關(guān)。
　　 根據(jù)BmIFV的5'端序列設(shè)計(jì)5條siRNA序列(siRNA-Loop4、siRNA-Loop7、siRNA-Loop8、siRNA-Loop12和siRNA-Loop15)，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法，將5條siRNA轉(zhuǎn)染到BmN細(xì)胞中，再用重組桿狀病毒vR-IFV599-F接種侵染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)RN Ai-Loop15可顯著抑制BmIFV IRES介導(dǎo)的下游的螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的表達(dá)。進(jìn)而