中藥對異育銀鯽CYP450的誘導與抑制及對恩諾沙星代謝的影響.pdf

1、以異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)為研究對象，建立異育銀鯽肝微粒體CYP1A和CYP3A活性測定方法，在此基礎上研究6種中藥對CYP1A和CYP3A的抑制效應，進一步探討了黃連素對CYP1A和CYP3A的抑制機制；同時，研究了中藥黃芩苷和甘草酸對恩諾沙星代謝的影響。本論文分為4篇，第一篇為中藥提取物對異育銀鯽肝微粒體CYP1A和CYP3A的抑制作用；第二篇是黃連素對異育銀鯽CYP4501A和3A抑制機制的探討；

2、第三篇是黃芩苷與甘草酸對恩諾沙星在異育銀鯽體內代謝的影響；第四篇是CYP450在恩諾沙星的N-脫乙基中的作用。
　　 主要內容如下：
　　 1.中藥對異育銀鯽肝微粒體CYP1A和CYP3A的抑制作用
　　 在建立的微粒體體系中，研究黃芩、柴胡、連翹、吳茱萸、野菊花和黃連素等6種中藥對異育銀鯽肝微粒體P450酶的影響，體外測定IC50以及相關酶動力學參數，并推測其可能的作用機制。結果顯示，孵育體系內源性物質不干擾測

3、定，方法快捷、穩(wěn)定、靈敏度高，且6種中藥對7-乙氧基異吩唑酮-O-脫乙基酶(EROD)(CYP1A標志酶)的抑制程度為黃連素>黃芩>連翹>野菊花>柴胡>吳茱萸，IC50依次為0.0038，0.27，2.88，7，62，16.20和16.42mg/mL，酶促反應動力學常數Vmax和Km為83.33±11.32pmol/(minmg)和3.05±0.89μM。據此計算黃連素、黃芩、連翹、野菊花、柴胡和吳茱萸的抑制常數分別為0.00028，0

4、.165，0.39，0.61，0.40和0.59mg/mL；黃連素、黃芩、連翹和吳茱萸對紅霉素-N-脫甲基酶(ERND)(CYP3A標志酶)抑制作用很弱，IC50分別為0.68，90.9，70.8和43.5mg/mL，未檢測到柴胡和野菊花對ERND有抑制作用。結果表明，這6種中藥對CYP酶的影響因亞型不同而區(qū)別較大，對CYP1A的抑制均較顯著，而對CYP3A的抑制則不明顯；同時研究它們對CYP1A的體外抑制機制，推測黃連素、黃芩、柴胡和

5、吳茱萸對EROD的抑制為競爭性抑制，野菊花和連翹則是反競爭性抑制。
　　 2.黃連素對異育銀鯽CYP4501A和3A的抑制機制研究
　　 為了深入探討中藥對P450的抑制機制，選擇黃連素，在異育銀鯽體內從藥酶活性、蛋白量和蛋白表達水平，探討了鹽酸黃連素對CYP1A和CYP3A的抑制機制。通過單次腹腔注射不同劑量黃連素(5mg/kg，25mg/kg，50mg/kg和100mg/kg)后研究異育銀鯽CYP1A和CYP3A活性

6、的變化規(guī)律，低劑量(5mg/kg)時肝微粒體的7-乙氧基異吩唑酮-O-脫乙基酶(EROD)與紅霉素-N-脫甲基酶(ERND)活性相比對照組沒有變化(p>0.05)，高劑量(25mg/kg，50mg/kg和100mg/kg)肝微粒體EROD與ERND活性均隨黃連素劑量增加而降低，最大劑量(100mg/kg)時分別比對照組下降了67.27％和85.83％(p<0.01)。Western-blotting表明，給藥組肝臟中CYP1A和CYP3

7、A蛋白含量隨黃連素劑量增加依次降低，CYP3A的最高劑量(100mg/kg)相比對照下降了88.6％；而CYP1A給藥各組與對照相比沒有顯著性差異(p>0.05)。定量RT-PCR結果顯示，給藥組肝臟中CYP1A和CYP3AmRNA含量隨黃連素劑量增加依次降低，最高劑量(100mg/kg)相比對照分別下降了85.0％和91.5％。由此說明黃連素對CYP1A和CYP3A的調控為抑制，但抑制機制不同，黃連素對1A的抑制主要發(fā)生在轉錄水平，而

8、對3A的抑制在轉錄水平和翻譯水平都有體現(xiàn)。通過體外孵育實驗得出，黃連素對EROD的IC50為11.5μM，抑制動力學常數Km和Vmax為0.83μM和102.04pmol/minpermgprotein，Ki為0.85μM；而在體外，黃連素對ERND的抑制作用很弱，IC50為204.3μM，筆者推測黃連素對3A的抑制作用主要發(fā)生的體內。綜合體內外實驗，筆者建議：在與由CYP1A和3A參與代謝的藥物同時使用時，應注意到黃連素增加聯(lián)合使用藥

9、物的血藥濃度，改變其藥物代謝動力學.
　　 3.黃芩苷與甘草酸對恩諾沙星在異育銀鯽體內代謝的影響
　　 CYP450酶是參與藥物代謝的主要的酶系，然而CYP450具有可誘導性，常常會被一些外源性的化學物質(包括許多臨床常用藥物)所誘導，從而產生藥物間相互作用。本文研究了黃芩苷(Baicalin，BL)和甘草酸(Glycyrrhizin，GZ)口灌異育銀鯽后對恩諾沙星(Enrofloxacin，EF)在該動物體內代謝的影響

10、。異育銀鯽連續(xù)7d分別口灌BL(100mg/kg)、GZ(100mg/kg)、一組給藥后24h腹腔注射EF(10mg/kg)，采用單個動物連續(xù)采血，HPLC測定血清EF和環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CF)濃度，分析藥動學及其參數；另一組檢測肝微粒體CYP1A和CYP3A活性。結果表明，(1)BL和GZ對藥物EF的吸收有明顯影響，主要表現(xiàn)在峰濃度(Cmax)降低，曲線下面積(AUC)減少。(2)口灌BL和GZ后，實驗組EF與CF

11、的AUC與t1/2z明顯小于對照組，而清除率(CL)則增大，說明BL和GZ促使EF消除加快。(3)口灌BL和GZ后，BL和GZ的CmaxCF/CmaxEF比值分別1.48％、2.22％，對照為0.95％；BL和GZ的AUCCF/AUCEF比值分別為2.16％、1.76％，而對照組為1.7％。綜合CmaxCF/CmaxEF和AUCCF/AUCEF比值可以得出，BL和GZ對EFN-脫乙基具有誘導作用。(4)BL和GZ組7-乙氧基異吩唑酮-O

12、-脫乙基酶(EROD，CYP1A標志酶)和紅霉素-N-脫甲基酶(ERND，CYP3A標志酶)活性顯著升高(p<0.05)，說明BL和GZ對CYP1A和CYP3A都有誘導作用。結合以上結果，推論BL和GZ加速EF的消除和其代謝產物CF的生成可能與其誘導CYP1A和CYP3A活性有關。
　　 4.CYP450在恩諾沙星的N-脫乙基中的作用
　　 通過第三篇得到CYP1A與3A的誘導與恩諾沙星代謝相關性較大，本文通過體內誘導誘

13、導和體外抑制CYP450酶后，對異育銀鯽恩諾沙星N-脫乙基化代謝的影響。體內試驗：異育銀鯽連續(xù)7d分別口灌β-萘黃酮(BNF)(12mg/kg)和利福平(RIF)(12mg/kg)，試驗分2組，一組為給藥后24h腹腔注射恩諾沙星(10mg/kg)，采用單個動物連續(xù)采血，HPLC測定血漿恩諾沙星和環(huán)丙沙星濃度，分析藥動學及其參數；另一組提取微粒體，檢測肝微粒體CYP1A和CYP3A活性；體外實驗：微粒體與思諾沙星共同孵育，HPLC檢測EF

14、的代謝產物環(huán)丙沙星的生成率，同時以酮康唑和黃連素作為陰性對照。體內實驗結果：(1)口灌利福平和β-萘黃酮后，EF和CF的t1/2z和AUC均下降，而CLZ/F上升，由此可見，2種藥物均能促進了恩諾沙星和其代謝產物環(huán)丙沙星在體內的消除。(2)口灌利福平和β-萘黃酮后，代謝產物環(huán)丙沙星的峰濃度分別為0.435±0.138mg/L和0.048±0.007mg/L，對照組為0.099±0.029mg/L；利福平和β-萘黃酮的AUCCF/AUCE

15、F比值分別為3.69％和1.84％，而對照組為1.76％。綜合峰濃度和AUCCF/AUCEF比值，利福平對恩諾沙星N-脫乙基化具有誘導作用。(3)BNF組7-乙氧基異吩唑酮-O-脫乙基酶(EROD，CYP1A標志酶)和RIF組紅霉素-N-脫甲基酶(ERND，CYP3A標志酶)活性顯著升高(p<0.05)。體外實驗結果：RIF組微粒體與恩諾沙星孵育后，環(huán)丙沙星生成率上升(p<0.05)，而將酮康唑與空白微粒體一起孵育后，環(huán)丙沙星生成率下降