“腦神經(jīng)血管單元”體外模型的成模性研究.pdf

1、背景:
　　 “腦神經(jīng)血管單元”是包括大腦神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、微血管等在內(nèi)的一個整體概念，在腦神經(jīng)血管疾病的研究和治療中具有重要意義。課題組前期用原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮層神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，采用Tanswell細(xì)胞培養(yǎng)小池，在體外初步建立了“腦神經(jīng)血管單元”整體結(jié)構(gòu)模型，但其方法還不夠穩(wěn)定成熟，對于整體結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)性及其與在體功能的吻合性的驗(yàn)證還不足。本文的研究是在前期工作基礎(chǔ)上進(jìn)行方法學(xué)的改進(jìn)、穩(wěn)定，使其成熟，并

2、驗(yàn)證其整體結(jié)構(gòu)的相互關(guān)聯(lián)性及其與在體“腦神經(jīng)血管單元”功能的相似性。
　　 本課題獲得了教育部博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)基金（博導(dǎo)類:20110182110012）;重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研重大項(xiàng)目（渝中醫(yī)2010160]2010-1-4）的支持。
　　 目的:
　　 1.改進(jìn)并穩(wěn)定建模用三種細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法和神經(jīng)血管單元三細(xì)胞共培養(yǎng)模型建立方法，為進(jìn)一步研究提供穩(wěn)定成熟的技術(shù)手段。
　　 2.研究細(xì)胞特異性蛋白在缺

3、氧復(fù)氧損傷不同時間點(diǎn)的表達(dá)及其相互關(guān)系，驗(yàn)證體外建立的“腦神經(jīng)血管單元”模型與在體功能的相似性。
　　 方法:
　　 1.建模用三種大鼠腦細(xì)胞分離、培養(yǎng)與純化鑒定方法的改進(jìn)和穩(wěn)定
　　 建立大鼠腦皮層微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)與純化鑒定新方法本研究直接將25％的BSA加入獲取的皮質(zhì)層碎塊中，勻漿后梯度離心取微血管段，用0.1％的Ⅱ型膠原酶消化獲取微血管內(nèi)皮細(xì)胞，用含20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，不添加

4、生長因子，在傳代時通過差異消化法純化，用兔抗Ⅷ因子進(jìn)行鑒定。
　　 大鼠腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞分離、培養(yǎng)、純化與鑒定方法的改進(jìn)改進(jìn)課題組前期用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，用阿糖胞苷抑制非神經(jīng)元細(xì)胞生長來純化，用神經(jīng)元特異烯醇化酶(NSE)進(jìn)行鑒定的方法;本研究中，采用DMEM/F12培養(yǎng)基添加無血清B27進(jìn)行培養(yǎng)與純化，用神經(jīng)元特異性微管相關(guān)蛋白質(zhì)2(MAP-2)進(jìn)行鑒定。
　　 大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞分離、培養(yǎng)

5、與純化鑒定方法的穩(wěn)定方法同課題組前期方法:分離新生3d內(nèi)大鼠皮質(zhì)層星形膠質(zhì)細(xì)胞，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過搖瓶去除非星形膠質(zhì)細(xì)胞，用兔抗GFAP鑒定。
　　 2.“腦神經(jīng)血管單元”體外共培養(yǎng)模型建立方法的改進(jìn)與穩(wěn)定
　　 改變前期選用半透明transwell培養(yǎng)小池，神經(jīng)元培養(yǎng)傳代后接種到培養(yǎng)孔底，0.4mL/孔星形膠質(zhì)細(xì)胞混懸液接種，培養(yǎng)2天后接種微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法。本研究選用透明的tran

6、swell培養(yǎng)小池，神經(jīng)元直接接種在培養(yǎng)板孔底培養(yǎng)純化，在transwell膜外側(cè)種植lmL的星形膠質(zhì)細(xì)胞混懸液，貼壁后將小池插入神經(jīng)元培養(yǎng)孔，1d后在transwell膜內(nèi)側(cè)種植純化的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，共培養(yǎng)3d后用于模型評價和相關(guān)實(shí)驗(yàn)。通過倒置相差顯微鏡觀察三種細(xì)胞生長狀態(tài)、檢測4小時滲漏試驗(yàn)和跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值，評價模型構(gòu)建成功與否，評價正常培養(yǎng)時，該模型屏障功能與在體生理?xiàng)l件下的相似性。
　　 3.“腦神經(jīng)血管單元”體外共

7、培養(yǎng)模型氧復(fù)氧損傷方法的建立與穩(wěn)定
　　 將建模成功的培養(yǎng)池內(nèi)培養(yǎng)基換成無血清缺氧液，放入持續(xù)通入混合氣體的、37℃恒溫恒濕的缺氧裝置中處理4h，再將缺氧液換成復(fù)氧液，于正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。通過倒置相差顯微鏡觀察模型中三種細(xì)胞生長狀態(tài)、檢測4小時滲漏試驗(yàn)和跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值，評價模型缺氧復(fù)氧損傷的成功與否;評價缺氧復(fù)氧損傷后，該模型屏障功能變化與在體病理?xiàng)l件下的相似性。
　　 4.“腦神經(jīng)血管單元”體外模型缺氧復(fù)氧損傷中細(xì)

8、胞特異性蛋白動態(tài)變化研究
　　 在缺氧前、復(fù)氧0h、復(fù)氧2h、復(fù)氧6h、復(fù)氧12h及復(fù)氧24h六個時間點(diǎn)分別提取不同培養(yǎng)方式下三種細(xì)胞蛋白，經(jīng)過前處理后用WB方法檢測神經(jīng)元GAP-43、微血管內(nèi)皮細(xì)胞Claudin-5、星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4的表達(dá)。通過比較上述功能蛋白在缺氧復(fù)氧損傷時表達(dá)變化與在體缺血再灌注損傷過程中表達(dá)變化，評價缺氧復(fù)氧損傷后，該模型中細(xì)胞功能變化與在體病理?xiàng)l件下的相似性。
　　 結(jié)果:
　　

9、 1.方法改進(jìn)后，分離培養(yǎng)的三種建模用新生大鼠腦原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)均一，呈現(xiàn)出各自典型的生長特征。經(jīng)特異性蛋白鑒定，神經(jīng)元純度達(dá)95％以上，較改進(jìn)前提高10％;星形膠質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)96％以上，較改進(jìn)前提高6％;微血管內(nèi)皮細(xì)胞純度達(dá)99％以上，較改進(jìn)前提高4％。改進(jìn)后的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法操作簡單，耗時短，不需添加昂貴的生長因子，且節(jié)約動物使用量。
　　 2.本研究采用透明transwell膜來改進(jìn)了課題組前期用半透明transw

10、ell膜建立三細(xì)胞共培養(yǎng)模型的方法，并優(yōu)化建模中細(xì)胞種植時間、數(shù)量等條件，建立了穩(wěn)定的三細(xì)胞共培養(yǎng)模型，不僅使建模時間縮短，而且便于直接觀察細(xì)胞生長狀態(tài)和拍照。三細(xì)胞共培養(yǎng)體中，細(xì)胞共生長良好，星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體粗大并充分伸展、微血管內(nèi)皮細(xì)胞形成單層、神經(jīng)元軸突形成致密的網(wǎng)絡(luò)，基本符合在體生長形態(tài)。通過比較單細(xì)胞培養(yǎng)、雙細(xì)胞共培養(yǎng)和三細(xì)胞共培養(yǎng)生長結(jié)果，表明三細(xì)胞共培養(yǎng)模型細(xì)胞之間具有明顯的相互促進(jìn)生長的整體協(xié)同效應(yīng)。4小時滲漏試驗(yàn)中各孔

11、液面均無明顯下降，跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值達(dá)到268.3±6.5(Ωcm2)。表明該模型具有“腦神經(jīng)血管單元”中基本的屏障功能，相似于在體“腦神經(jīng)血管單元”的部分生理功能。
　　 3.缺氧復(fù)氧損傷后，三種細(xì)胞形態(tài)變化較大。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞均不同程度出現(xiàn)胞體回縮，細(xì)胞間隙增加，神經(jīng)元突觸縮短并減少，但三細(xì)胞共培養(yǎng)模型中細(xì)胞形態(tài)受損程度小于雙細(xì)胞共培養(yǎng)和單細(xì)胞培養(yǎng)。顯示三細(xì)胞共培養(yǎng)體缺氧復(fù)氧損傷后，與在體腦組織缺血再灌注損傷后

12、細(xì)胞形態(tài)變化相似，而且較單細(xì)胞或雙細(xì)胞培養(yǎng)具有更強(qiáng)的抗損傷能力。與損傷前相比:三細(xì)胞共培養(yǎng)體4小時滲漏試驗(yàn)降低顯著(P＜0.01)。跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值為227.1±3.3(Ωcm2)，下降明顯(P＜0.01)。顯示缺氧復(fù)氧損傷后。該三細(xì)胞共培養(yǎng)模型具有相似于在體“腦神經(jīng)血管單元”缺血再灌注損傷的細(xì)胞病理變化。
　　 4.雙細(xì)胞共培養(yǎng)和單細(xì)胞培養(yǎng)時，神經(jīng)元GAP-43和微血管內(nèi)皮細(xì)胞Claudin-5的表達(dá)在復(fù)氧后0-2小時就極顯著

13、降低(P＜0.001);三細(xì)胞共培養(yǎng)體中，神經(jīng)元GAP-43在復(fù)氧后6小時才開始明顯降低(P＜0.05)，該兩種蛋白在復(fù)氧后12小時才達(dá)到極顯著降低(P＜0.001)。雙細(xì)胞共培養(yǎng)和單細(xì)胞培養(yǎng)時，星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4的表達(dá)在復(fù)氧后0-2小時就極顯著升高(P＜0.001);在三細(xì)胞共培養(yǎng)體中，其表達(dá)在復(fù)氧后2小時才顯著升高(P＜0.05)，在復(fù)氧24小時時才達(dá)到極顯著升高(P＜0.001)。顯示缺氧復(fù)氧損傷后，三細(xì)胞共培養(yǎng)體與在體腦組織

14、缺血再灌注損傷后細(xì)胞蛋白變化相似，而且較單細(xì)胞或雙細(xì)胞培養(yǎng)具有更強(qiáng)的抗損傷能力。該三細(xì)胞共培養(yǎng)模型具有相似于在體“腦神經(jīng)血管單元”缺血再灌注損傷的細(xì)胞蛋白病理變化。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究建立了一種新的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，改進(jìn)了大鼠腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法，穩(wěn)定了大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。所獲得的大鼠腦皮層三種原代細(xì)胞純度較高，為后續(xù)研究提供了穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)方法，也可作為相關(guān)研究細(xì)胞培養(yǎng)的

15、技術(shù)參考。
　　 2.本研究改進(jìn)并穩(wěn)定了“腦神經(jīng)血管單元”體外模型建模方法，使建模時間縮短，且便于直接觀察細(xì)胞生長狀態(tài)和拍照。所建模型中的三種腦細(xì)胞具有類似于在體腦組織細(xì)胞之間相互促進(jìn)生長的作用，具有生理屏障功能。顯示所建立的模型具有與在體“腦神經(jīng)血管單元”相似的部分生理功能。
　　 3.本研究建立了穩(wěn)定的“腦神經(jīng)血管單元”體外模型缺氧復(fù)氧損傷方法。該方法損傷后，“腦神經(jīng)血管單元”體外模型具有相似于在體腦組織細(xì)胞的病理形

16、態(tài)學(xué)變化特點(diǎn)。該方法損傷后“腦神經(jīng)血管單元”體外模型中神經(jīng)元GAP-43、微血管內(nèi)皮細(xì)胞Claudin-5和星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4的表達(dá)，具有類似于在體缺血再灌注損傷后腦組織細(xì)胞蛋白的變化特點(diǎn)。
　　 4.與單細(xì)胞培養(yǎng)或者雙細(xì)胞培養(yǎng)比較，三細(xì)胞共培養(yǎng)模型細(xì)胞之間具有明顯的相互促進(jìn)生長的整體協(xié)同效應(yīng)?！澳X神經(jīng)血管單元”體外模型中細(xì)胞在缺氧復(fù)氧損傷條件下，更加具有類似于在體腦組織細(xì)胞之間相互保護(hù)、增強(qiáng)抵御損傷能力的作用。