組織工程人工神經(jīng)血管化的實驗研究.pdf

1、一種理想的組織工程人工神經(jīng)應(yīng)該是由種子細胞、生物材料、細胞外基質(zhì)以及誘導和促進神經(jīng)生長的因子等幾部分構(gòu)成的有機統(tǒng)一體。在課題組前期的工作中我們已經(jīng)先后通過探討了組織工程人工神經(jīng)的種子細胞—雪旺細胞培養(yǎng)方法，獲得了較大數(shù)量、較高純度的雪旺細胞。通過改良去細胞同種異體神經(jīng)橋接體的制備方法，獲得了較為理想的人工神經(jīng)天然支架。隨后的雪旺細胞與去細胞同種異體神經(jīng)橋接體的體外組織相容性研究也證實:采用胎兔坐骨神經(jīng)培養(yǎng)的雪旺細胞能在用成年兔坐骨神經(jīng)制

2、備的去細胞橋神經(jīng)接體中生長良好，并且具有遷移成行的特性。在前期研究基礎(chǔ)上本課題將嘗試將血管內(nèi)皮細胞與雪旺細胞聯(lián)合培養(yǎng)移植以促進組織工程人工神經(jīng)血管化，進一步探討組織工程人工神經(jīng)再血管化策略。
　　為此，本課題擬從以下三個方面開展研究:(1)將胎兔雪旺細胞復合體橋接修復兔坐骨神經(jīng)缺損的動物實驗研究，明確胎兔雪旺細胞神經(jīng)復合體修復周圍神經(jīng)缺損可行性;(2)體外雪旺細胞與血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)的實驗研究，探討將雪旺細胞和血管內(nèi)皮細胞聯(lián)合培養(yǎng)

3、的最適比例;(3)將血管內(nèi)皮細胞與組織工程人工神經(jīng)中的種子細胞-雪旺細胞聯(lián)合種植至預先制備好的去細胞同種異體神經(jīng)段中，嘗試先在體外對神經(jīng)移植體行預血管化，并用這種預血管化的人工神經(jīng)重建成年兔坐骨神經(jīng)的功能。觀察比較預血管化處理和不進行預血管化處理兩種移植復合體對神經(jīng)功能恢復的影響。通過上述三個方面的研究，探討早期預血管化移植體對神經(jīng)功能恢復的影響。
　　第一部分種植胎兔雪旺細胞重新細胞化的脫細胞異體神經(jīng)修復神經(jīng)缺損的動物實驗

4、>　　目的:利用胎兔坐骨神經(jīng)培養(yǎng)雪旺細胞，然后將其在體外與經(jīng)化學去細胞處理的同種異體神經(jīng)段形成重新細胞化的神經(jīng)橋接復合體，并用于修復成年兔坐骨神經(jīng)缺損，探討種植雪旺細胞的去細胞神經(jīng)橋接復合體修復周圍神經(jīng)缺損的可行性。
　　方法:實驗包括胎兔雪旺細胞培養(yǎng)、去細胞神經(jīng)橋接體的制備以及去細胞神經(jīng)橋接體復合體的動物實驗三個部分。使用雙酶消化法培養(yǎng)雪旺細胞并將其種植于經(jīng)3％ TritonⅩ-100作用96h后的同種異體神經(jīng)中。實驗組:將胎兔

5、雪旺細胞神經(jīng)復合體橋接用于移植修復成年兔坐骨神經(jīng)缺損。對照組:單純應(yīng)用未重新細胞化的去細胞同種異體神經(jīng)段移植修復成年兔坐骨神經(jīng)缺損。分別觀察兩組坐骨神經(jīng)的再生及功能恢復情況，觀察兔的足部潰瘍形成及愈合情況。于4周，8周，12周行肌電圖檢查，在光鏡下觀察神經(jīng)軸突的再生情況，并進行統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果:實驗組和對照組兩組動物分別在術(shù)后第4周、第8周和第12周時觀察，非常明顯的排斥反應(yīng)均未在手術(shù)操作的局部區(qū)域或全身出現(xiàn)。實驗組足部潰瘍

6、愈合情況、再生神經(jīng)纖維數(shù)目與對照組相比有顯著差異（對照組差于實驗組）。神經(jīng)傳導速度(NCV)的比較:①在術(shù)后第4周時，實驗組和對照組均未出現(xiàn)特別明顯的神經(jīng)傳導;②在術(shù)后第8周時，神經(jīng)傳導速度實驗組為24.80±1.27 m/s，對照組為18.72±0.81 m/s，T值-10.91，P＜0.05;③在術(shù)后第8周時，神經(jīng)傳導速度實驗組為37.95±2.43m/s，對照組為32.58±1.89 m/s，T值-5.01，P＜0.05。兩組有顯

7、著差異性。神經(jīng)纖維數(shù)目的比較:①在術(shù)后第4周時實驗為750.65±74.24根，對照組為543.67±61.42根，T值-5.30，P＜0.05;②在術(shù)后第8周時，實驗組為2067.83±231.65根，對照組為1804.50±156.65根，T值-2.29，P＜0.05;③在術(shù)后第12周時，實驗組為34340.33±124.48根，對照組為2495.17±154.95根，T值-11.25，P＜0.05。兩組比較有顯著差異性。
　

8、　結(jié)論:胎兔雪旺細胞能在經(jīng)去細胞處理的同種異體神經(jīng)中生長并發(fā)揮生物活性，種植胎兔雪旺細胞重新細胞化后的同種異體神經(jīng)不僅可以為新生軸突生長提供具有良好空間結(jié)構(gòu)的支架，而且與單純化學去細胞處理的異體神經(jīng)相比，重新細胞化后的同種異體神經(jīng)在誘導和促進新生神經(jīng)軸突再生等方面更具優(yōu)勢。
　　第二部分胎兔血管內(nèi)皮細胞與胎兔雪旺細胞在體外共同培養(yǎng)體系的建立
　　目的:在體外將雪旺細胞和血管內(nèi)皮細胞聯(lián)合培養(yǎng)，建立最適比例的胎兔血管內(nèi)皮細胞與胎

9、兔雪旺細胞在體外共同培養(yǎng)體系，為進一步探討組織工程人工神經(jīng)再血管化策略提供實驗依據(jù)。
　　方法:取胎兔坐骨神經(jīng)以及胸主動脈采用酶消化法分別進行單獨培養(yǎng)胎兔SCs和VECs，隨后將培養(yǎng)好的胎兔SCs和VECs移入含20％胎牛血清的DMEM/F12及M199的混合培養(yǎng)基中，根據(jù)移入的SCs和VECs細胞數(shù)量比例分別設(shè)為實驗組的A組(1∶1)、B組(2∶1)、C(4∶1)三組，各組DMEM/F12及M199培養(yǎng)基的比例根據(jù)細胞比例也作相

10、應(yīng)調(diào)整。與此同時，將相同數(shù)量的SCs繼續(xù)進行單獨培養(yǎng)并設(shè)為對照組D。各組分別在細胞培養(yǎng)后的第1、3、5、7天，對SCs進行計數(shù)并根據(jù)計數(shù)情況繪制SCs的生長曲線。
　　結(jié)果:1隨著細胞培養(yǎng)時間的增加，各組SCs的數(shù)量也不斷增加，SCs和VECs能夠在同一細胞培養(yǎng)孔中各自生長。2在細胞共同培養(yǎng)第1天，A、B、C三個實驗組與對照組D中的SCs細胞數(shù)量無顯著性差異(P＞0.05），在細胞共同培養(yǎng)的第3天、第5天、第7天，A組和C組SCs

11、計數(shù)與對照組D相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05），D組的SCs數(shù)量高于A、C兩組;B實驗組的SCs數(shù)量與對照組D相比則無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05），實驗組B與實驗組A、C則有顯著差異(P＜0.05），B組SCs數(shù)量高于A、C兩組。
　　結(jié)論:利用胎兔坐骨神經(jīng)培養(yǎng)的SCs能夠在體外與利用胸主動脈培養(yǎng)的VECs進行共同培養(yǎng);在胎兔血管內(nèi)皮細胞與胎兔雪旺細胞體外共同培養(yǎng)的體系中，當VECs與SCs的比例為1∶2時，SCs的生長能力及活

12、性維持最好。
　　第三部分血管化同種異體神經(jīng)復合體橋接修復兔坐骨神經(jīng)缺損的實驗研究
　　目的:探討將經(jīng)化學去細胞處理的同種異體神經(jīng)復合體預血管化處理后移植修復兔長段坐骨神經(jīng)缺損的可行性以及早期血管化移植體對神經(jīng)功能恢復的影響。
　　方法:將雪旺細胞與血管內(nèi)皮細胞在體外聯(lián)合培養(yǎng)成功后將其種植于預先制備的經(jīng)脫細胞處理完善的同種異體神經(jīng)段中，制備成預血管化的人工神經(jīng)并將其用于修復兔缺坐骨神經(jīng)缺損（實驗組），對照組移植體中單純

13、種植雪旺細胞，無血管內(nèi)皮細胞。術(shù)后4周，8周，16周對兩組動物行肌電圖檢查，觀察神經(jīng)功能恢復情況，然后，手術(shù)取材，應(yīng)用光鏡、電鏡觀察坐骨神經(jīng)再生和髓鞘形成情況，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)對髓鞘厚度以及有髓神經(jīng)纖維軸突的直徑、數(shù)目進行量化分析。
　　結(jié)果:
　　1、大體觀察，術(shù)后4周、8周、16周兩組動物全身及局部均未出現(xiàn)明顯的排斥反應(yīng)。足部潰瘍恢復情況以及步態(tài)恢復情況實驗組均優(yōu)于對照組;
　　2、術(shù)后8周實驗組神經(jīng)傳導速度為23

14、.35±1.05m/s，對照組為23.11±0.80m/s，T值2.13，P＜0.05。術(shù)后16周實驗組神經(jīng)傳導速度為39.52±1.0 m/s，對照組為38.34±0.15 m/s，T值2.15，P＜0.05。
　　3、脛前肌濕重測量:4周時兩組動物脛前肌濕重（實驗組2.22±0.13g，對照組2.20±0.16g）組間無顯著差異(P＞0.05)。8周時實驗組3.38±0.11 g，對照組3.28±0.07g，T值2.89，P＜

15、0.05，組間有顯著差異。術(shù)后12周實驗組6.10±0.22g，對照組5.97±0.15g，T值2.14，P＜0.05，組間有顯著差異。
　　4、再生神經(jīng)纖維的數(shù)量:4周時實驗組為922.97±25.06，對照組為901.48±12.39，T值3.26，P＜0.05，組間有顯著差異。8周時實驗組為1736.44±36.28，對照組為1713.51±25.00，T值2.20，P＜0.05，組間有顯著差異。12周時實驗組為2840.9

16、1±20.93，對照組為2823.74±14.42，T值2.86，P＜0.05，組間有顯著差異。
　　5、有髓神經(jīng)纖維軸突直徑:4周時實驗組為5.83±0.16μm，對照組為5.58±0.42μm，T值2.27，P＜0.05，組間有顯著差異。8周時實驗組為6.01±0.09μm，對照組為5.87±0.16μm，T值3.09，P＜0.01，組間有顯著差異。12周時實驗組為6.11±0.08μm，對照組為6.00±0.07μm，T值4

17、.62，P＜0.0001，組間有顯著差異。
　　6、髓鞘厚度:4周時實驗組為1.95±0.14μm，對照組為1.70±0.22μm，T值4.10，P＜0.05，組間有顯著差異。8周時實驗組為1.99±0.11μm，對照組為1.85±0.16μm，T值3.10，P＜0.01，組間有顯著差異。12周時實驗組為2.03±0.05μm，對照組為1.90±0.06μm，T值7.16，P＜0.0001，組間有顯著差異。
　　結(jié)論:應(yīng)用預