Caveolae在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖、分化中調(diào)控作用的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 急性肺損傷（acute lung injury, ALI）、急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distresssyndrome, ARDS）、肺炎、肺水腫等多種肺部疾病都伴隨肺泡上皮屏障的破壞，肺泡上皮屏障的修復(fù)直接關(guān)系到患者預(yù)后。肺泡上皮屏障由肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞（alveolarepitheliAlcells type Ⅰ, AECⅠ）和Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolar epithel

2、iAlcells type Ⅱ，AECⅡ）
　　 構(gòu)成，其中AECⅡ作為肺泡上皮細(xì)胞的干細(xì)胞，可在肺損傷后通過有絲分裂增殖補(bǔ)充自身的數(shù)量，并向AECⅠ轉(zhuǎn)分化來修復(fù)肺泡上皮屏障。因此，了解AECⅡ增殖和轉(zhuǎn)分化機(jī)制對(duì)肺部疾病的治療具有重要意義。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1,TGFβ1）介導(dǎo)的Smad通路是AECⅡ增殖和轉(zhuǎn)分化中的重要通路。TGFβ1/Smad通路的激活可以顯著抑制AEC

3、Ⅱ增殖和轉(zhuǎn)分化，影響肺泡上皮屏障的修復(fù)。小窩（Caveolae）
　　 是細(xì)胞質(zhì)膜表面特異性的內(nèi)陷微區(qū)，直徑約50～100nm，主要由小窩蛋白（Caveolin）、膽固醇、糖基鞘磷脂、鞘磷脂組成。Caveolae 主要存在于高度分化的細(xì)胞，在內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中尤為豐富，是正常細(xì)胞行為所必須的、具有特殊功能的膜結(jié)構(gòu)。Caveolae是細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞和物質(zhì)交換的重要通道，在多種細(xì)胞增殖及分化中起

4、重要作用，但在AECⅡ增殖和分化中的作用尚不明確。為此本實(shí)驗(yàn)通過甲基-β-環(huán)糊精（methyl-β-cyclodextrin, MβCD）干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠AECⅡ細(xì)胞膜Caveolae 結(jié)構(gòu)，研究其對(duì)AECⅡ增殖、分化和TGFβ1/Smad通路的影響及其機(jī)制，探討Caveolae在肺泡上皮屏障的修復(fù)中的作用。
　　 方法：
　　 1.通過酶消化分離和免疫黏附法純化，原代培養(yǎng)大鼠AECⅡ細(xì)胞，經(jīng)堿性磷酸酶、肺泡表面活性蛋

5、白-C（surfactant protein C, SP-C）熒光染色鑒定。
　　 2.將所培養(yǎng)的細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、MβCD組。細(xì)胞計(jì)數(shù)、四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。
　　 3.免疫熒光雙標(biāo)和蛋白質(zhì)印跡（western blot 法）檢測兩組SP-C及水通道蛋白-5（aquaporin5, AQP-5）的表達(dá)。
　　 4.免疫熒光雙標(biāo)染色和非離子去污劑法提取脂筏，

6、檢測TGF-β受體Ⅰ（typeⅠtransforming growth factor βrecepter, TβR-Ⅰ）與小窩蛋白-1（Caveolin-1）在細(xì)胞膜上的分布；Western blot 檢測Caveolin-1和TGF-β1/Smad信號(hào)通路下游分子磷酸化Smad2（phosphorylated Smad2, p-Smad2）表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)堿性磷酸酶、SP-C 熒光染色鑒定，原代培養(yǎng)A

7、ECⅡ細(xì)胞成功。
　　 2.MβCD組干預(yù)后細(xì)胞數(shù)目、增殖率與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)相比顯著降低（P<0.05）；
　　 MβCD組G0/G1期細(xì)胞比例較對(duì)照組顯著增多，S 期細(xì)胞比例較對(duì)照組顯著減少（P<0.05），提示破壞Caveolae 結(jié)構(gòu)使AECⅡ細(xì)胞由G0/G1期向S 期轉(zhuǎn)化的百分比減少，細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，顯著抑制細(xì)胞增殖。
　　 3.對(duì)照組干預(yù)后48h 同時(shí)表達(dá)AECⅠ的細(xì)胞標(biāo)志物AQP-5和AE

8、CⅡ的細(xì)胞標(biāo)志物SP-C，MβCD組僅表達(dá)SP-C；對(duì)照組干預(yù)后72h 主要表達(dá)AQP-5，提示AECⅡ已轉(zhuǎn)分化為AECⅠ，MβCD組主要表達(dá)SP-C，仍顯示AECⅡ的表型，提示轉(zhuǎn)分化受到抑制；
　　 與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)比較，MβCD組SP-C蛋白表達(dá)明顯增多，AQP-5蛋白表達(dá)明顯減少（P<0.05），提示破壞Caveolae 結(jié)構(gòu)可以顯著抑制AECⅡ向AECⅠ轉(zhuǎn)分化。
　　 4.TβR-Ⅰ主要分布于AECⅡ細(xì)胞膜上的

9、Caveolae 區(qū)域，MβCD 破壞Caveolae 結(jié)構(gòu)后，TβR-Ⅰ重新分布于細(xì)胞膜上非脂筏區(qū)域。MβCD組與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)比較，Caveolin-1蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.05），TGF-β1/Smad信號(hào)通路下游分子p-Smad2蛋白表達(dá)較對(duì)照組增多（P<0.05），提示破壞Caveolae 結(jié)構(gòu)可以引起TβR-Ⅰ在非脂筏區(qū)域的聚集，減少TGF-β1的降解；此外，Caveolin-1蛋白表達(dá)減少，對(duì)TGF-β1/Smad通

10、路的抑制減弱，導(dǎo)致TGF-β1/Smad通路激活。
　　 結(jié)論：
　　 1.Caveolae 結(jié)構(gòu)破壞后，AECⅡ細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，顯著抑制細(xì)胞增殖，提示Caveolae通過對(duì)細(xì)胞周期的影響，參與AECⅡ的細(xì)胞增殖。
　　 2.干預(yù)Caveolae 結(jié)構(gòu)可以顯著抑制AECⅡ向AECⅠ轉(zhuǎn)分化，提示Caveolae在AECⅡ轉(zhuǎn)分化過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用。
　　 3.Caveolae結(jié)構(gòu)破壞可以引起TGF