irf5慢病毒干擾載體構(gòu)建及巨噬細胞j774a.1穩(wěn)定沉默細胞系的建立

1、 I暨南大學碩士學位論文 IRF5 慢病毒干擾載體構(gòu)建及巨噬細胞 慢病毒干擾載體構(gòu)建及巨噬細胞 J774A.1 穩(wěn)定沉默細胞系的建立 穩(wěn)定沉默細胞系的建立Construction of Lentiviral Interference Vector of IRF5 and Establishment of Macrophages J774A.1 Cells with IRF5 Gene Silence 作者姓名：麥莉 指導教師姓名 及學位

2、、職稱：韋建瑞 碩士 主任醫(yī)師 學科、專業(yè)名稱：內(nèi)科學 心血管病學 論文提交日期：2016-04-10 論文答辯日期：2016-06-01 答辯委員會主席： 論文評閱人： 學位授予單位和日期：暨南大學 2016-07 暨南大學碩士學位論文 IRF5 慢病毒干擾載體構(gòu)建及巨噬細胞 J774A.1 穩(wěn)定沉默細胞系的建立 I中文摘要 中文摘要 目 的 構(gòu)建 IRF5 慢病毒干擾載體以及建立 IRF5 基因沉默巨噬細

3、胞 J774A.1 穩(wěn)定細胞系 方 法 1．構(gòu)建攜帶IRF5 shRNA的慢病毒干擾質(zhì)粒載體，進行病毒包裝后轉(zhuǎn)染J774A.1 巨噬細胞， 建立穩(wěn)定IRF5 基因沉默的J774A.1/IRF5 -巨噬細胞系。 首先利用Oligo Designer3.0 化學合成方法得到 4 種IRF5 shRNA（IRF5-MUS-649、IRF5-MUS-1059、IRF5-MUS-1322、IRF5-MUS-1578），分別將 4 種IRF5

4、shDNA進行PCR擴增后與目的載體進行酶切， 酶切純化后的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細菌感受態(tài)細胞。 對陽性克隆進行酶切鑒定以及測序， 以證實目的基因已經(jīng)定向連接目的載體，比對準確的即為構(gòu)建成功的目的基因慢病毒表達質(zhì)粒載體。 大量質(zhì)粒抽提后利用293T細胞進行病毒包裝，檢測并標定各病毒液滴度。 2．使用 LV3-NC （陰性對照） 、LV3-649、 LV3-1059、 LV3-1322、 LV3-1578病毒原液分別對正常 J774A.1 巨噬

5、細胞株進行侵襲測試， 通過熒光表達計數(shù)挑選最佳的病毒侵襲濃度；用上述 4 種病毒液分別對 J774A.1 細胞浸染，對浸染后各組細胞進行分組， 并設(shè)立空白對照組， 從浸染細胞中提取 RNA 及蛋白， 用 RT-PCR和 Western-Blot 方法進行檢測， 明確實驗組細胞 IRF5 表達水平是否有明顯下降；另外，測試 Puromycin 對正常 J774A.1 巨噬細胞最小致死濃度，以挑選最佳最低的細胞篩選濃度。 結(jié) 果 1．通過