乳酸桿菌抑制Hela細胞增殖的可能機制研究.pdf

1、目的：
　　宮頸癌現(xiàn)階段的治療方法主要包括手術(shù)、放化療，手術(shù)往往會使女性失去生育能力。放化療也給患者帶來巨大的生理、心理痛苦?，F(xiàn)在隨著對宮頸癌、癌前病變的認識加深，發(fā)現(xiàn)自身免疫在疾病的發(fā)生、發(fā)展或疾病的逆轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)歸乃至自愈過程中發(fā)揮著重要作用。
　　乳酸桿菌是存在于人和動物口腔、消化道、陰道的正常菌群。在臨床上，乳酸桿菌主要用于增強患者的免疫力?，F(xiàn)今關(guān)于陰道菌群與HPV感染、宮頸癌前病變、宮頸癌的發(fā)生之間的研究越來越多。有研究

2、顯示乳酸桿菌可以抑制宮頸癌增殖。本研究亦發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌能很好的抑制宮頸癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移。
　　癌細胞的無限增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的基礎，Cyclin作為控制細胞增殖、凋亡的原癌基因受到了廣泛關(guān)注，乳酸桿菌可以抑制宮頸癌細胞的生長，但是乳酸菌抑制宮頸癌細胞生長、增殖的機制尚不明確。
　　本研究旨在探求乳酸桿菌抑制宮頸癌細胞增殖的可能機制，為以后乳酸桿菌預防與治療宮頸癌提供理論依據(jù)，并力圖探索宮頸癌治療的可能靶點。
　　方法：

3、
　　基于前期實驗，發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌與Hela細胞MOI為1000:1的狀態(tài)下，作用效果最佳,本次實驗乳酸桿菌與Hela細胞MOI均為1000:1。
　　1乳酸桿菌對宮頸癌Hela細胞增殖作用
　　1.1增殖實驗
　　乳酸桿菌作用Hela細胞0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h，MTS細胞增殖試劑盒檢測乳酸桿菌對Hela細胞增殖的影響。
　　1.2乳酸桿菌抑制Hela細胞增殖的可能機制研究

4、>　　乳酸桿菌直接作用于Hela細胞，以3×105/孔鋪于6孔板中,置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱過夜。乳酸桿菌以MOI1000:1作用于細胞。對照組加入2ml無雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h、24h、36h、48h、60h、72h后，收集細胞備用。
　　1.2.1實時定量PCR檢測乳酸桿菌作用后Dvl-1、Dvl-2、Dvl-3、GSK3β、CSL、NLK、CyclinD1 mRNA水平變化。
　　1.2.2 Wester

5、n blot檢測乳酸桿菌作用后不同時間點β-catenin、GSK3β、CSL、NLK、CyclinD1的蛋白水平變化。
　　2行SiRNA干擾Hela細胞NLK的基因表達后，乳酸桿菌對Hela細胞增殖作用的影響。
　　2.1實時定量PCR檢測SiRNA干擾效果
　　2.2增殖實驗
　　設置空白對照組、陰性干擾組、干擾組，SiRNA作用24h后，加入乳酸桿菌作用0h、12h、24h、36h、48h、60h，MTS

6、細胞增殖試劑盒檢測乳酸桿菌對干擾NLK基因表達后的Hela細胞增殖的影響。
　　2.3實時定量PCR檢測SiRNA干擾Hela細胞后，乳酸桿菌作用48h NLK、CyclinD1核酸水平變化，Western blot檢測NLK、CyclinD1蛋白水平變化。
　　3統(tǒng)計方法
　　用SPSS（21.0版）統(tǒng)計軟件行數(shù)據(jù)分析，對于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以平均值±標準差描述，兩樣本間行t檢驗或t＇檢驗，多樣本分析運用方差分析；非

7、正態(tài)數(shù)據(jù)用秩和檢驗，對于率、比的比較行卡方檢驗。
　　結(jié)果：
　　1乳酸桿菌作用Hela細胞后，顯微鏡下顯示隨著作用時間延長，Hela細胞生長速度減慢，細胞碎片隨時間增加明顯增多，MTS結(jié)果顯示乳酸桿菌作用36小時后，細胞增殖明顯減弱，乳酸桿菌作用組與空白組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（F=20.793，P=0.000145）。
　　2乳酸桿菌作用Hela細胞后，Wnt通路中的接頭蛋白Dvl的三個亞基（Dvl-1、Dvl-

8、2、Dvl-3）mRNA水平表達趨勢一致，表現(xiàn)為菌作用后其表達量迅速增加，24小時后，表達逐漸減少，提示乳酸桿菌作用后，可能激活了Wnt通路。GSK3βmRNA水平整體呈上升趨勢，與空白對照組相比，具有顯著差異（F=25.549，P=0.000）；然而GSK3β蛋白表達量明顯降低（F=34.151，P=0.000），呈時間依賴性；原因可能是活化的Dvl蛋白能抑制GSK-3β的活性。與其結(jié)合的靶蛋白β-catenin在乳酸桿菌作用細胞后，

9、與空白對照組相比，表達量顯著升高，但不同作用時間組之間無顯著差異。然而其下游的CyclinD1無論是mRNA水平還是蛋白水平呈現(xiàn)穩(wěn)定的下降趨勢，與空白對照組相比，差異具有顯著性。提示乳酸桿菌并非通過激活經(jīng)典Wnt通路發(fā)揮抑制Hela細胞增殖作用。
　　3乳酸桿菌作用Hela細胞后，Notch通路中的關(guān)鍵接頭分子CSL無論從mRNA水平還是蛋白水平的表達量與空白對照組相比均顯著增加；而受其抑制的下游的CyclinD1無論是mRNA水

10、平還是蛋白水平呈現(xiàn)穩(wěn)定的下降趨勢，與空白對照組相比，差異具有顯著性。提示Notch通路中的接頭分子CSL可能在乳酸桿菌抑制Hela細胞增殖作用中發(fā)揮作用。
　　4 BMP通路中的關(guān)鍵分子NLK則在乳酸桿菌作用細胞后，其mRNA水平表達不穩(wěn)定，但NLK的蛋白表達隨作用時間顯著增多（F=20.703， P=0.000），而受其抑制的下游的CyclinD1無論是mRNA水平還是蛋白水平呈現(xiàn)穩(wěn)定的下降趨勢，與空白對照組相比，差異具有顯著性

11、。
　　5 SiNLK干擾Hela細胞中NLK表達后，NLK抑制率達80%。
　　6 SiNLK干擾NLK表達后，SiNLK干擾組Hela細胞生長狀態(tài)優(yōu)于空白對照組、陰性干擾組，MTS結(jié)果顯示SiNLK干擾組細胞增殖優(yōu)于空白對照、陰性干擾組。乳酸桿菌加入后，干擾組細胞生長狀態(tài)仍優(yōu)于空白對照組、陰性干擾組。MTS結(jié)果顯示SiNLK干擾組的細胞增殖明顯優(yōu)于空白對照組、陰性干擾組，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　7 Hela細胞中

12、NLK表達被干擾后，乳酸桿菌再作用細胞48h，CyclinD1無論mRNA水平或蛋白水平的表達量都較干擾前或陰性干擾組明顯升高?？瞻讓φ战M與陰性干擾組間無統(tǒng)計學差異（P=0.091）。提示BMP通路中的NLK在乳酸桿菌抑制Hela細胞增殖發(fā)揮重要作用。
　　結(jié)論：
　　1乳酸桿菌可以抑制Hela細胞增殖、生長。
　　2乳酸桿菌作用Hela細胞后CyclinD1表達顯著降低。
　　3乳酸桿菌并非通過Wnt經(jīng)典途徑抑