茯苓多糖抑制宮頸癌hela細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、目的:宮頸癌(cervical carcinoma)是女性最常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，居第二位?；瘜W(xué)藥物治療為中、晚期宮頸癌，轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散或復(fù)發(fā)宮頸癌患者的姑息治療方法，化療藥物在致腫瘤細(xì)胞死亡的同時(shí)對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的毒副作用,且長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用化療藥物后，常出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥反應(yīng)，最終導(dǎo)致化學(xué)藥物治療宮頸癌方法失敗。如能尋找對(duì)腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)靶作用、且有一定療效的新型制劑治療宮頸癌，或利用它們?cè)黾蝇F(xiàn)有化療藥物的化療效果，改善目前的

2、化療狀況就顯得極其重要。本實(shí)驗(yàn)旨在研究茯苓多糖(Pachymaram)對(duì)人宮頸癌hela細(xì)胞株增殖的作用，及與紫杉醇聯(lián)合用藥對(duì)人宮頸癌hela細(xì)胞株體外生長(zhǎng)的影響，以期在臨床上改善藥物治療宮頸癌現(xiàn)狀，為制定宮頸癌化療方案提供新思路。
　　方法:
　　1．細(xì)胞培養(yǎng)：常規(guī)方法復(fù)蘇凍存于液氮罐中的宮頸癌hela細(xì)胞，離心、洗滌后，制成單細(xì)胞懸液，接種于含10％小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于37℃,5%二氧化碳飽和

3、濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)(約3-5天)，胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，以備實(shí)驗(yàn)用。
　　2．染料排斥法測(cè)定：把制備成單個(gè)細(xì)胞的懸液用培養(yǎng)液稀釋五倍，取9滴細(xì)胞懸液移入試管中，加1滴0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液，混勻，在3min內(nèi)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。
　　3．流式細(xì)胞儀測(cè)定：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，既細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí)，常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液，以1×105/ml密度接種于培養(yǎng)瓶中，24h后換液，

4、加入藥物或培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，收集所有細(xì)胞，將約1×105個(gè)細(xì)胞移入離心管中，1000rpm離心8分鐘，棄去上清后，連續(xù)兩次，用PBS溶液清洗一次，在離心管中留約0.5mlPBS，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，加入70％冰乙醇5ml混勻固定，4℃放置48h以上，檢測(cè)時(shí)，離心離去乙醇，沉淀物經(jīng)PBS離心洗滌2次，在離心管中留1mlPBS，打散細(xì)胞團(tuán)，以500目銅網(wǎng)過(guò)濾成單細(xì)胞懸液，濃度約為1*105個(gè)/ml。加入Rnase5ul(10mg/ml)，

5、37℃放置1h，以消除RNA的干擾，離心，用冷PBS洗一次，加入PI（100ug/ml）染液，室溫避光染色30分鐘，計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期，測(cè)得的數(shù)據(jù)和圖形輸入 B.D公司提供的流式細(xì)胞分析軟件，以低于G1期DNA含量的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，應(yīng)用相應(yīng)程序進(jìn)行資料處理。
　　結(jié)果:
　　1、倒置像差顯微鏡觀(guān)察：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)欠規(guī)則，偽足回縮，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核核仁染色不均，細(xì)胞核核物質(zhì)分散，細(xì)胞深染

6、，凋亡小體出現(xiàn)。對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良，細(xì)胞透明，呈復(fù)層性生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形或多角形，易融合形成集落，細(xì)胞漿內(nèi)顆粒較少，細(xì)胞核隱約可見(jiàn)。
　　2、臺(tái)盼藍(lán)染料排斥法檢測(cè)：顯示茯苓多糖對(duì)宮頸癌hela細(xì)胞體外生長(zhǎng)的增殖有抑制作用，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，描繪生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖可知，經(jīng)不同濃度茯苓多糖處理后的hela細(xì)胞較對(duì)照組生長(zhǎng)緩慢，表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)抑制，而對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，呈典型的生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染料染色后，在光鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，結(jié)果表明，與對(duì)照組比

7、較活細(xì)胞數(shù)減少，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著性。茯苓多糖單獨(dú)用藥，濃度分別為（3mg/ml,6mg/ml,12mg/ml)對(duì) hela細(xì)胞體外生長(zhǎng)均具有抑制增殖作用，經(jīng)不同濃度的茯苓多糖處理細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，差異具有顯著性，且隨著茯苓多糖藥物濃度的增大、茯苓多糖作用時(shí)間的延長(zhǎng)，活細(xì)胞數(shù)隨之下降。綜上結(jié)果表明，茯苓多糖對(duì) hela細(xì)胞的增殖抑制作用有明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系。茯苓多糖(3mg/ml)與紫杉醇(0.043mg/ml)

8、聯(lián)合用藥作用 hela細(xì)胞后，與對(duì)照組或與單獨(dú)應(yīng)用紫杉醇組（0.043mg/ml）相比，活細(xì)胞數(shù)差異具有顯著性，上述結(jié)果表明，茯苓多糖與紫杉醇聯(lián)合用藥對(duì) hela細(xì)胞的增殖抑制作用具有協(xié)同作用。
　　3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)hela細(xì)胞周期分布和凋亡顯示：用藥24小時(shí)后，隨藥物濃度增大，G2/M期比例逐漸增多，S期比例則逐漸減少，且出現(xiàn)典型的亞二倍體凋亡峰，凋亡百分率茯苓多糖組分別為1.9%、3.3%、10.3%;紫杉醇組為2.6%，聯(lián)

9、合用藥組為9.2%。上述結(jié)果表明，茯苓多糖用藥24小時(shí)后可阻滯hela細(xì)胞周期進(jìn)程于G2/M期，茯苓多糖與紫杉醇聯(lián)合用藥組，24小時(shí)可阻滯hela細(xì)胞周期進(jìn)程于G2/M期，比例較單獨(dú)應(yīng)用紫杉醇組增高。
　　結(jié)論:
　　1、本試驗(yàn)首次通過(guò)體外試驗(yàn)證實(shí)茯苓多糖單獨(dú)應(yīng)用對(duì) hela細(xì)胞的體外生長(zhǎng)有增殖抑制作用，增殖抑制作用呈劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系。
　　2、本試驗(yàn)證實(shí)應(yīng)用茯苓多糖可阻滯宮頸癌hela細(xì)胞周期于G2/M