阿司匹林抑制宮頸癌Hela細胞增殖及其機制研究.pdf

1、目的：宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，嚴重危害著女性的生命健康。據(jù)統(tǒng)計，2000年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例47萬，死亡病例23萬，現(xiàn)患病例140萬。目前認為人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌的主要致病原因。早期宮頸癌不論手術(shù)治療還是放療，效果均比較滿意，但中晚期宮頸癌治療效果差，化療對中晚期宮頸癌的治療效果是肯定的，但化療藥物如果長期大量的應(yīng)用，藥物在作用于腫瘤的同時還可能引發(fā)嚴重的副反應(yīng)，而且可導(dǎo)致腫瘤的耐藥性。因此尋找更為有效的治療

2、藥物及方法是一個迫切需要解決的問題。 阿司匹林為非甾體類消炎藥，其藥理作用為抑制環(huán)氧化酶的活性，降低前列腺素的合成。文獻報道阿司匹林對腫瘤細胞的生長有抑制作用，可以抑制食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤以及子宮內(nèi)膜癌的生長：最近流行病學(xué)研究證實，阿司匹林及其它非甾體類消炎藥具有降低腫瘤發(fā)病率的作用，腫瘤組織中COXs過度表達，PGE<,2>產(chǎn)生過多，可刺激腫瘤細胞的增殖及機體的腫瘤免疫機能降低。目前國內(nèi)外有

3、關(guān)阿司匹林抗宮頸癌的研究均很少。本研究以人宮頸癌Hela細胞為研究對象，探討阿司匹林對宮頸癌Hela細胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡情況，檢測bcl-2和bax基因的表達變化，觀察凋亡細胞形態(tài)學(xué)變化，進一步探討阿司匹林抑制宮頸癌Hela 細胞增殖機制，以期對臨床治療宮頸癌提供理論依據(jù)。 方法：1．細胞培養(yǎng)：常規(guī)方法復(fù)蘇宮頸癌 Hela 細胞，接種于含10％胎牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37℃、5％CO<,2>飽和濕度培養(yǎng)

4、箱內(nèi)培養(yǎng)。 2．流式細胞儀檢測(FCM)：以含0、1、5、10mmol/L 濃度阿司匹林的培養(yǎng)液培養(yǎng)}tela細胞48小時，用流式細胞儀定量分析經(jīng)不同濃度阿司匹林處理的細胞凋亡率和細胞周期變化情況。 3．反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：提取 Hela 細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄擴增后取擴增產(chǎn)物，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，檢測用藥前后凋亡相關(guān)基因bcl-2和bax的表達。 4．DNALadder測

5、定：提取Hela細胞DNA，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳進一步檢測Hela細胞發(fā)生的DNA降解。 5．細胞增殖抑制實驗(MTT還原法)：用含0、0.5、1、5、10mmol/L濃度阿司匹林的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)Hela細胞24、48、72、96小時，用MTT還原法檢測細胞增殖抑制情況。 6．細胞形態(tài)學(xué)觀察：用含0、1、5、10mmol/L 濃度阿司匹林的培養(yǎng)液培養(yǎng)Hela細胞72小時，倒置像差顯微鏡觀察并用Giemsa染色后在光學(xué)

6、顯微鏡下觀察凋亡細胞形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果：1．流式細胞儀檢測結(jié)果：流式細胞儀檢測表明經(jīng)不同濃度阿司匹林作用48小時后，與對照組相比，隨阿司匹林濃度增加，實驗組 Hela細胞凋亡率升高明顯 (P<0.05)，細胞周期發(fā)生明顯變化；隨著阿司匹林濃度的增加，G<,0>/G<,1>期細胞比例減少，而G<,2>/M期細胞比例增加(P<0.05)。說明阿司匹林在G<,2>/M期阻斷Hela細胞增殖。 2．阿司匹林對Hela細胞bcl-

7、2和bax基因mRNA表達的影響：阿司匹林作用于Hela細胞前后，細胞中的bcl-2基因mRNA表達明顯降低，而bax基因mRNA表達明顯升高，兩種基因表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 3．阿司匹林作用 Hela 細胞后細胞基因組DNA變化：提取對照組和實驗組細胞：DNA，經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳顯示實驗組DNA出現(xiàn)降解，呈明顯的梯狀條帶，表明阿司匹林能誘導(dǎo) Hela 細胞凋亡。 4.阿司匹林對 Htela 細胞增

8、殖的抑制作用：采用 MTT 法檢測細胞增殖抑制率，描繪生長柱狀圖和曲線圖可知，經(jīng)不同濃度阿司匹林處理后的Hela細胞生長緩慢，表現(xiàn)出明顯的生長抑制，并呈作用濃度和時間的依賴性，而對照組細胞生長良好。 5.阿司匹林作用 Hela細胞后形態(tài)學(xué)變化：倒置像差顯微鏡觀察，對照組細胞生長良好，細胞透明，密度較大，呈復(fù)層性生長，細胞呈梭形或多角形，易融合形成集落，細胞漿內(nèi)顆粒較少，細胞核隱約可見；實驗組細胞密度明顯減小，細胞顆粒較多，細胞間

9、界線模糊，漂浮細胞數(shù)量增加，存活細胞明顯減少。經(jīng)Giemsa染色后進行光鏡觀察，可見細胞形態(tài)也出現(xiàn)明顯改變，對照組細胞形態(tài)飽滿、偽足伸展，細胞核染色均勻，核仁清晰可見；實驗組細胞中出現(xiàn)形態(tài)變小、偽足回縮，細胞質(zhì)濃縮、變圓，核仁染色不均，核物質(zhì)邊集，高倍鏡下可見凋亡細胞體積縮小，細胞膜皺縮，染色體濃縮，細胞核固縮、斷裂，核仁消失，形成大小不等的凋亡小體。與對照組相比，凋亡細胞染色加深，尤其細胞膜染色更明顯。在光鏡下計凋亡小體百分數(shù)，結(jié)果表