乙型肝炎病毒X蛋白誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、背景:
　　肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)越來越常見,據(jù)報道其發(fā)病率居惡性腫瘤發(fā)病率的前五,而其致死人數(shù)居每年惡性腫瘤致死人數(shù)的前三。我國是肝細(xì)胞癌(以下簡稱肝癌)的高發(fā)地區(qū),而慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染經(jīng)流行病學(xué)研究證實(shí)是我國原發(fā)性肝癌的第一大致病因素。慢性乙型肝炎病毒感染進(jìn)展為肝硬化,最終進(jìn)展為肝癌是 HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的常規(guī)過程,但其

2、中的機(jī)制研究仍未取得突破性進(jìn)展。而由HBV X基因編碼的乙型肝炎病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein, HBx)被認(rèn)為密切地參與了這一過程。HBx是由HBV X基因編碼的多功能蛋白,廣泛參與多種基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列過程。
　　就目前而言,肝癌的具體發(fā)病機(jī)制仍未完全明了。普遍來說,肝癌的發(fā)生是一個多因素影響、多機(jī)制參與的過程。這些復(fù)雜的因素及機(jī)制被傳統(tǒng)腫瘤發(fā)生理論歸納為正常肝

3、細(xì)胞在各種致癌因素下,正常的生理機(jī)制被破壞,發(fā)生異常的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。而近些年來新提出的腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)理論為肝癌的發(fā)生闡釋了另一個角度的可能。簡單而言,腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤由腫瘤干細(xì)胞分化而來,而腫瘤干細(xì)胞則可能源于各種因素及機(jī)制作用下的正常的干細(xì)胞異常轉(zhuǎn)化。
　　肝卵圓細(xì)胞(hepatic oval cell, HOC)作為一種具有多方向分化潛在能力的肝內(nèi)細(xì)胞,被公認(rèn)為肝干細(xì)胞。一

4、系列研究提示肝卵圓細(xì)胞(以下簡稱卵圓細(xì)胞)可能參與了原發(fā)性肝癌的發(fā)生,在肝癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。
　　目的:
　　研究HBx對肝卵圓細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用,探討HBx是否能誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞向肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　方法:
　　1.構(gòu)建表達(dá)HBx和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒載體LV-HBx-PM和對應(yīng)的僅表達(dá)嘌呤霉素抗性基因的空慢病毒載體 LV-PM。分別用構(gòu)建好的慢病毒 LV-HBx-PM和LV-PM感染W(wǎng)B-F344卵圓細(xì)胞

5、。將感染慢病毒LV-HBx-PM的WB-F344卵圓細(xì)胞標(biāo)記為WB-F344-HBx,設(shè)為實(shí)驗(yàn)組;將感染對照慢病毒LV-PM的WB-F344卵圓細(xì)胞標(biāo)記為 WB-F344-PM,設(shè)為陰性對照組;將未感染病毒并且培養(yǎng)相同代數(shù)的 WB-F344卵圓細(xì)胞標(biāo)記為WB-F344-Mock,設(shè)為空白對照組。經(jīng)篩選培養(yǎng),使用real-time RT-PCR和Western-blot分別在基因和蛋白水平檢測HBx的表達(dá)。
　　2.使用流式細(xì)胞術(shù)檢

6、測 WB-F344-HBx、WB-F344-PM和 WB-F344-Mock細(xì)胞的細(xì)胞周期。
　　3.使用MTT法檢測WB-F344-HBx、WB-F344-PM和WB-F344-Mock細(xì)胞的增殖能力。
　　4.使用Transwell法檢測WB-F344-HBx、WB-F344-PM和WB-F344-Mock細(xì)胞的遷移能力。
　　5.分別將 WB-F344-HBx、WB-F344-PM和 WB-F344-Mock卵圓

7、細(xì)胞接種于裸鼠左側(cè)腋窩皮下,每組6只,接種6周后處死裸鼠,觀察各組卵圓細(xì)胞成瘤的情況。
　　6.采用 HE染色的方法觀察移植瘤組織情況,用免疫組織化學(xué)染色檢測移植瘤組織中HBx和AFP的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.WB-F344-HBx在基因水平和蛋白水平穩(wěn)定高效表達(dá) HBx;WB-F344-PM和WB-F344-Mock不表達(dá)HBx。
　　2.實(shí)驗(yàn)組WB-F344-HBx與陰性對照組WB-F344-PM相比,G

8、0/G1期細(xì)胞比例降低[(55.98±0.39)％vs.(63.73±2.02)%,P<0.01],G2/M期細(xì)胞比例升高[(15.05±1.67)%vs.(7.41±0.38)%,P<0.01]。陰性對照組WB-F344-PM和空白對照組WB-F344-Mock相比,細(xì)胞周期無顯著差異。
　　3.實(shí)驗(yàn)組 WB-F344-HBx與陰性對照組 WB-F344-PM相比,細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(P<0.01)。陰性對照組WB-F344-PM

9、和空白對照組WB-F344-Mock相比,細(xì)胞增殖能力無顯著差異。
　　4.在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中,WB-F344-Mock、WB-F344-PM、WB-F344-HBx細(xì)胞均具有細(xì)胞遷移能力,透膜細(xì)胞數(shù)分別為249.60±17.28個/視野、42.50±14.34個/視野和35.30±10.00個/視野。實(shí)驗(yàn)組WB-F344-HBx與陰性對照組WB-F344-PM相比細(xì)胞遷移數(shù)目明顯增多(P<0.01),而陰性對照組 WB-F344-

10、PM與空白對照組 WB-F344-Mock相比細(xì)胞遷移數(shù)目無顯著差異。
　　5.接種后6周的飼養(yǎng)過程中,陰性對照組裸鼠死亡1只,其余兩組裸鼠在飼養(yǎng)期內(nèi)無死亡。實(shí)驗(yàn)組裸鼠成瘤(5/6例),腫瘤直徑7±1.9mm,陰性對照組裸鼠成瘤(0/5例),空白對照組裸鼠成瘤(0/6例)。HE染色顯示實(shí)驗(yàn)組移植瘤腫瘤組織呈侵潤性生長。免疫組織化學(xué)染色顯示實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織 HBx表達(dá)陽性,而AFP表達(dá)陰性。結(jié)合病理觀察結(jié)果和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果,排除