斑馬魚腫瘤腦轉移模型的構建與應用.pdf

1、惡性腫瘤現已成為我國居民的主要死亡原因。轉移是惡性腫瘤難治、易復發(fā)的主要原因，其中腫瘤腦轉移是惡性腫瘤轉移的最嚴重后果之一，一旦發(fā)生腦轉移，預后非常差，5年存活率極低。因此，研究腫瘤細胞腦轉移機制對于我國癌癥病人來說具有重要意義。黑素瘤、肺癌和乳腺癌是最易發(fā)生腦轉移的三種癌癥。本課題旨在應用模式動物斑馬魚，建立用于腫瘤腦轉移機制研究的活體模型，并進一步探索腫瘤腦轉移的分子機制以及腫瘤細胞外泌體在腫瘤腦轉移中的作用。研究結果總結如下:

2、r>　　1.在血腦屏障形成前(2dpf)、后(4dpf)的斑馬魚胚胎心包腔部位注射帶有紅色熒光標記的鼠源性黑素瘤細胞tfRFP-B16-F10，對腫瘤細胞的轉移進行檢測和統(tǒng)計:胚胎存活率、注射部位含有腫瘤細胞團的數目和各個部位包括頭部、軀干、尾部的轉移灶數目，以及總體轉移灶數目。同時我們選取移植后的幼魚進行活體成像實驗，實時觀察腫瘤細胞突破血腦屏障(Brain-Blood-Barrier，BBB)進入腦組織的過程，我們發(fā)現腫瘤細胞是通過

3、不斷地變形穿過腦內皮細胞間隙進入腦實質，在腦內皮細胞間緊密連接出現以后，腫瘤細胞的腦轉移率大大降低，而緊密連接正是血腦屏障實現其功能的主要一部分，因此，我們得出結論:血腦屏障在抑制腫瘤細胞腦轉移的過程中發(fā)揮了重要作用，另外，通過對發(fā)生腦轉移2d后的斑馬魚幼魚進行長時程轉盤共聚焦拍攝，我們發(fā)現腦轉移的腫瘤細胞沿著血管壁擴增延伸，細胞集群不斷擴大，這與之前文獻報道的腦轉移生長情況相符，而且通過本部分實驗，我們成功建立了研究腫瘤腦轉移的斑馬魚

4、模型。
　　2.在血腦屏障開始形成后即3dpf的斑馬魚幼魚心包腔部位注射3-D纖維軟膠培養(yǎng)富集的tfRFP-B16-F10高致瘤性細胞和普通培養(yǎng)的tfRFP-B16-F10腫瘤細胞，分別統(tǒng)計注射不同培養(yǎng)腫瘤細胞的胚胎存活率、注射部位腫瘤細胞團的數目和各個部位包括頭部、軀干、尾部的轉移灶數目，以及總體轉移灶數目。數據統(tǒng)計結果表明3-D纖維軟膠培養(yǎng)的高致瘤性細胞無論是總體轉移率還是腦轉移率都要高于普通培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的腫瘤細胞。因此，高致瘤

5、性細胞的轉移潛能更強。另外，我們利用熒光顯微鏡連續(xù)觀察同一條幼魚體內轉移的腫瘤細胞，可以很明顯的觀察腫瘤細胞在轉移部位的生長。
　　3.外泌體是30-100um的囊泡結構，在腫瘤細胞轉移過程中起重要作用，然而對于其作用機制的了解還不全面，因此我們擬利用本課題所建立的腫瘤腦轉移斑馬魚模型研究外泌體促進腦轉移的分子機制。我們利用DiI熒光染料使體外提取的外泌體帶上紅色熒光，將DiI-exosomes注射進2dpf的斑馬魚胚胎心包腔部位

6、，利用轉盤共聚焦顯微鏡觀察外泌體與血腦屏障腦內皮細胞間的相互作用，我們發(fā)現外泌體可以被綠色熒光標記的腦微血管內皮細胞吸收，并且紅色熒光與腦內皮細胞的綠色熒光存在共定位長達4h甚至更長，結果說明外泌體與腦內皮細胞間存在相互作用，而這種相互作用很可能對腫瘤細胞穿過血腦屏障具有重要影響。我們先后嘗試了5次tfRFP-B16-F10及其外泌體的共注射以及1次非小細胞肺癌細胞A549及其外泌體的共注射，監(jiān)測腦轉移，并進行統(tǒng)計分析，然而實驗結果與預