人類(lèi)卟啉癥及貧血的斑馬魚(yú)疾病模型的建立與解析.pdf

1、血紅素（heme）是生物體內(nèi)一種重要的分子，參與組成血紅蛋白、肌紅蛋白、細(xì)胞色素P450、維生素B1等。血紅素的合成由8步酶催化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)組成，相應(yīng)的催化酶分別由對(duì)應(yīng)的基因編碼，包括ALAS1和ALAS2、ALAD、HMBS、UROS、UROD、CPOX、PPOX、FECH。血紅素合成過(guò)程中的酶的功能的缺陷導(dǎo)致一系列被稱(chēng)為卟啉癥（porphyria）的綜合癥。卟啉癥的臨床癥狀復(fù)雜，目前的診斷和治療手段相對(duì)有限。斑馬魚(yú)作為一種模式生物，在

2、人類(lèi)疾病的研究中有著廣泛的應(yīng)用，其相應(yīng)基因缺陷的突變體能夠作為人類(lèi)卟啉癥的疾病模型。已有報(bào)道斑馬魚(yú)alas2，urod，ppox，fech基因缺陷的突變體能夠分別作為人類(lèi)先天性鐵粒幼細(xì)胞性貧血癥（CSA）、肝性紅細(xì)胞生成性卟啉癥（HEP）、雜色卟啉癥（VP）、細(xì)胞生成性原卟啉癥（EPP）的疾病模型，但其他幾種卟啉癥還沒(méi)有可穩(wěn)定遺傳的斑馬魚(yú)疾病模型。
　　本文運(yùn)用TALEN技術(shù)建立了斑馬魚(yú)alad基因缺陷的突變體，作為人類(lèi)5-氨基酮

3、戊酸脫水酶缺乏性卟啉癥（ALA dehydratase deficient porphyria, ADP）的疾病模型。還運(yùn)用CRISPR-Cas9技術(shù)建立了斑馬魚(yú)cpox基因缺陷的突變體，作為人類(lèi)遺傳性糞卟啉癥（Hereditary coproporphyria,HCP）的疾病模型。對(duì)兩種突變體的表型分析顯示，與野生型相比，alad-/-和cpox-/-突變體的血紅素合成受阻，體內(nèi)血紅素含量顯著減少，血細(xì)胞發(fā)育異常，血紅蛋白含量顯著下降

4、，中間產(chǎn)物異常累積，同時(shí)血紅素合成通路中的相關(guān)基因表達(dá)水平異常。此外，人ALAD mRNA和CPOX mRNA分別能夠解救斑馬魚(yú)alad-/-和cpox-/-的表型，說(shuō)明alad和cpox的功能在人和斑馬魚(yú)中具有保守性。
　　斑馬魚(yú)中存在兩個(gè)編碼血紅素合成第三步反應(yīng)酶的基因，分別為hmbsa和hmbsb。系統(tǒng)樹(shù)分析表明這兩個(gè)基因?yàn)閺?fù)制基因，是人HMBS基因的共同直系同源基因（co-orthologs）。本文運(yùn)用CRISPR-Cas

5、9和TALEN技術(shù)建立了斑馬魚(yú)hmbsa和 hmbsb基因缺陷的突變體，作為人類(lèi)急性間歇性卟啉癥（Acute intermittent porphyria,AIP）的疾病模型，并對(duì)其表型進(jìn)行了分析。兩種純合突變體均顯示血紅素缺失的貧血癥狀，并且突變體表型的顯著程度隨等位基因的缺失程度而增加。同時(shí)與野生型相比，兩種突變體幼魚(yú)和成魚(yú)的行為均顯示異常。
　　為了對(duì)卟啉癥的病理機(jī)制做出更詳細(xì)的解析，本文還對(duì)兩種已有報(bào)道的斑馬魚(yú)卟啉癥及貧血

6、模型urod-/-和alas2-/-進(jìn)行了高通量深度測(cè)序轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果顯示血紅素的缺失導(dǎo)致大量基因的表達(dá)發(fā)生了改變。不同發(fā)育階段和不同突變體中的差異表達(dá)基因也不盡相同，顯示了卟啉癥的復(fù)雜性。
　　血紅素合成的限速酶基因alas1的表達(dá)受生物鐘系統(tǒng)調(diào)控，生物鐘系統(tǒng)通過(guò)血紅素偶聯(lián)能量代謝途徑。為了深入探究生物鐘系統(tǒng)與血紅素合成的相互作用關(guān)系，本文還運(yùn)用CRISPR-Cas9技術(shù)建立了斑馬魚(yú)per1a基因的突變體以及per基因全部敲除