聯(lián)合轉錄因子、GLP-1和Gastrin在大鼠骨髓間充質干細胞轉分化為胰島樣細胞中的作用機制.pdf

1、糖尿病作為一種慢性代謝性疾病嚴重影響著人們的健康，其主要病因為胰島素分泌相對和（或）絕對不足。胰島移植曾被認為是根治糖尿病的有效療法，但因供體來源不足及免疫排斥等限制其在臨床工作中的應用。目前非β細胞誘導分化為胰島樣細胞（insulin-producing cell，IPCs）移植治療糖尿病成為了世界范圍內關注的焦點。
　　骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是骨髓內

2、除造血干細胞之外的另一類干細胞。BMSCs多向分化、取材方便、體外易于培養(yǎng)及可自體移植等特性，使其成為誘導分化靶細胞的首選。
　　在胰島β細胞分化發(fā)育的過程中，轉錄因子起著至關重要的作用，其中最關鍵的轉錄因子主要包括胰十二指腸同源盒1（pancreatic and duodenal homeobox1，Pdx-1）、神經(jīng)元素3（Neurogenin3，Ngn3）和V型肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源基因A(v-maf muscu-loap

3、oneurotic fibrosarcoma oncogene homolog A，MafA)等。Pdx-1為胰腺發(fā)育過程中第一個關鍵轉錄因子，其作用主要是維持胰腺前體細胞的發(fā)育，參與胰腺分化發(fā)育的全過程。外源性導入Pdx-1基因不僅可成功誘導BMSCs分化為IPCs，而且可促進下游胰島素相關基因的表達。Ngn3是胰腺內分泌細胞發(fā)育的關鍵因子，其控制著胰腺內分泌祖細胞的分化方向，外源表達的Ngn3可促進胰腺導管細胞向IPCs分化。Maf

4、A是唯一特異存在于胰島β細胞的轉錄因子，其主要功能是在Pdx-1基因表達的前體下反式激活胰島素相關基因的表達，參與胰腺β細胞的形成以及維持胰腺β細胞的功能。研究發(fā)現(xiàn)轉錄因子聯(lián)合后可誘導BMSCs轉分化為永久編碼的IPCs。
　　胰島β細胞的再生和生物功能的維持還需要一些胃腸激素的參與，例如胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）和胃泌素（Gastrin）。GLP-1是腸粘膜 L細胞分泌的胃腸激

5、素，其主要是通過促進胰島素基因的轉錄、胰島素的合成和分泌，刺激胰島β細胞的增殖和分化并抑制其凋亡，進而保護β細胞并增加β細胞的數(shù)量。近年來，研究發(fā)現(xiàn)GLP-1還可以在體外誘導干細胞分化為IPCs，然而其作用機制尚未闡明。胃泌素是人體內另外一種重要的胃腸激素，其主要是由消化道黏膜中的G細胞分泌，研究發(fā)現(xiàn)其可促進糖尿病鼠胰腺組織體積增加以及胰島β細胞數(shù)量的增加。因此，我們推測GLP-1聯(lián)合胃泌素可進一步促進IPCs分化，且移植后可降低糖尿病

6、（diabetes mellitus,DM）大鼠的血糖。為此，本實驗開展以下研究。
　　第一部分、大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)及腺病毒載體的構建
　　目的：分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠BMSCs，構建pAd-Pdx-1-Ngn3-Cherry和pAd-MafA-EGFP腺病毒載體。
　　方法：
　　1.大鼠BMSCs的分離及培養(yǎng)：采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)原代大鼠BMSCs，流式細胞術鑒定大鼠BMSCs表面標志物CD34、C

7、D44和CD105，CCK-8測定大鼠BMSCs生長曲線。
　　2.腺病毒載體的構建: pAd–Cherry、pAd–EGFP、pAd-Pdx-1-Ngn3-Cherry、和pAd-MafA-EGFP腺病毒載體購買于上海吉凱基因化學有限公司，包裝和擴增均在293T細胞，病毒滴度為10-9-10-10/ml，儲存于-80℃冰箱。
　　結果：
　　1.原代大鼠BMSCs培養(yǎng)過程中，細胞逐漸由圓形透亮變成長梭形，符合大鼠 B

8、MSCs形態(tài)特征。流式細胞術鑒定CD34陽性率＜5％，CD44和CD105陽性率＞95%，符合大鼠BMSCs表面標志特征。
　　2.生長曲線表明細胞增殖能力良好。腺病毒載體序列符合基因序列。
　　結論：
　　1.體外成功分離大鼠BMSCs。
　　2.pAd-Pdx-1-Ngn3-Cherry和pAd-MafA-EGFP腺病毒載體構建成功。
　　第二部分、體外誘導大鼠BMSCs分化為IPCs
　　目的：

9、Pdx-1、Ngn3聯(lián)合MafA誘導大鼠BMSCs分化為IPCs，探討GLP-1和Gastrin進一步誘導IPCs分化的作用機制。
　　方法：
　　1．腺病毒載體感染大鼠BMSCs：pAd–Cherry和pAd–EGFP分別以MOI5-100感染大鼠BMSCs，觀察熒光及細胞狀態(tài)確定最佳MOI. pAd-Pdx-1-Ngn3-Cherry和pAd-MafA-EGFP以最佳MOI單獨及聯(lián)合感染大鼠BMSCs，培養(yǎng)于高糖培養(yǎng)基。

10、未感染組作為對照組。
　　2.感染后細胞鑒定及功能檢測（第一階段）：BMSCs分別感染pAd-Pdx-1-Ngn3-Cherry（Pdx-1-Ngn3感染組）、pAd-MafA-EGFP（MafA感染組）、pAd-Pdx-1-Ngn3-Cherry和pAd-MafA-EGFP（聯(lián)合感染組），未感染組作為空白對照（未感染組）。蛋白印記（Western blot）檢測感染后細胞中目的基因的表達；雙硫腙（DTZ）染色鑒定細胞分泌胰島素的

11、特性；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測感染后細胞不同時期胰島素的分泌情況；實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測感染后細胞Pdx-1、Nestin(巢蛋白)、GK（葡萄糖激酶）、Glucagon（胰高血糖素）、insulin2（胰島素基因2）mRNA的表達。
　　3.GLP-1和Gastrin誘導聯(lián)合感染細胞及功能分析（第二階段）：上述聯(lián)合感染細胞培養(yǎng)于高糖培養(yǎng)基后7天，分別培養(yǎng)于高糖培養(yǎng)基（聯(lián)合感染組）、高糖培養(yǎng)基

12、含GLP-1（GLP-1誘導組）、Gastrin（Gastrin誘導組）、GLP-1和Gastrin（聯(lián)合誘導組），酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測誘導染后細胞不同時期胰島素的分泌情況；實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測誘導后細胞Pdx-1、Nestin(巢蛋白)、GK（葡萄糖激酶）、Glucagon（胰高血糖素）、insulin2（胰島素基因2）mRNA的表達。
　　結果：
　　1.pAd-Pdx-1-N

13、gn3-Cherry和pAd-MafA-EGFP單獨及聯(lián)合感染的最佳MOI分別為50和30。
　　2.第一階段：Western blot顯示各感染組均有相應的蛋白表達，證實pAd-Pdx-1-Ngn3-Cherry和pAd-MafA-EGFP已成功感染大鼠BMSCs。感染后5天感染組細胞開始聚集，7天明顯聚集成團，且可被DTZ染成猩紅色，證實此時細胞已具備IPCs的特征。ELISA結果顯示各組均有胰島素分泌，聯(lián)合感染組胰島素的分泌

14、水平明顯優(yōu)于其他組，各組在感染第0、3、5、7、9天胰島素分泌水平逐漸提高，且聯(lián)合感染組升高最為明顯（P＜0.05）；RT-PCR結果顯示與未感染組相比，感染組Pdx-1、Insulin2、Glucagon及GK基因表達明顯上調(P＜0.05)；與MafA感染組相比，Pdx-1-Ngn3感染組Pdx-1表達上調，聯(lián)合感染組Pdx-1和Insulin2表達上調，Glucagon表達下調(P＜0.05)；與Pdx-1-Ngn3感染組相比，聯(lián)

15、合感染組Glucagon表達上調(P＜0.05)，聯(lián)合感染組GK、Insulin2 mRNA的表達明顯優(yōu)于其他誘導組。
　　3.第二階段：ELISA結果顯示各組均有胰島素分泌，聯(lián)合誘導組胰島素的分泌水平明顯優(yōu)于其他組，各組在誘導第0、3、5、7天胰島素分泌水平逐漸提高，且聯(lián)合誘導組升高最為明顯（P＜0.05）；RT-PCR結果顯示：與聯(lián)合感染組相比，GLP-1誘導組GK、Insulin2 mRNA的表達明顯上調（P＜0.05)，聯(lián)

16、合誘導組Pdx-1、GK、Insulin2 mRNA的表達明顯上調（P＜0.05)。
　　結論：
　　1.Pdx-1-Ngn3聯(lián)合MafA成功誘導大鼠BMSCs轉分化為IPCs。
　　2.GLP-1和Gastrin通過促進GK、Pdx-1和insulin2基因的表達促進IPCs的分化及功能的完善。
　　第三部分、IPCs移植治療T1DM大鼠
　　目的：探討IPCs在體內對T1DM大鼠體重及血糖變化的影響及機

17、制。
　　方法：
　　1.T1DM大鼠模型的建立：清潔級SD大鼠，體重220±10g，適應性飼養(yǎng)1周，禁食12h后，給予腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）60mg/kg。1周后監(jiān)測隨機血糖，3次隨機血糖＞16.7mmol/l則造模成功。
　　2.IPCs移植到T1DM大鼠體內：采用10%水合氯醛按照0.3ml/100g腹腔注射到大鼠體內進行麻醉。俯臥位固定大鼠四肢，備皮后左腎區(qū)行長約2cm縱行切口，逐層打開腹腔，將腎臟挑出腹

18、腔，小型鑷子夾起腎臟被膜，微量注射器將制備好的細胞懸液注射到腎臟下極。25只T1DM大鼠隨機分成5組，即假手術組：左腎被膜下移植10ulPBS；移植組A：左腎被膜下移植聯(lián)合感染組細胞2×106個；移植組B：左腎被膜下移植Gastrin誘導組細胞2×106個；移植組C：左腎被膜下移植GLP-1誘導組細胞2×106個；移植組D：左腎被膜下移植聯(lián)合誘導組細胞2×106個；另外5只正常大鼠左腎被膜下移植10ulPBS作為正常對照組。
　　

19、3．監(jiān)測大鼠體重及空腹血糖變化：移植后，第7,14,21,28天稱量各組大鼠的體重并記錄，禁食12h后，監(jiān)測各組大鼠空腹血糖水平并記錄。
　　4．腹腔糖耐量試驗：移植后28天，各組大鼠禁食12h，按照每公斤體重0.2g50%葡萄糖給予腹腔注射，并監(jiān)測注射前及注射后30min,60min,120min血糖。
　　5．腎臟免疫組織化學：行腹腔糖耐量實驗后，切除各組大鼠腎臟組織，固定于4%多聚甲醛用于免疫組化檢測。
　　結果

20、：
　　1．移植后，正常組大鼠體重以每周6-8g增加，而假手術組大鼠體重以每周3-5g減輕，移植組大鼠體重不但沒有出現(xiàn)明顯的下降，而且有所增加，且以移植組D大鼠體重增加最為顯著。假手術組大鼠血糖持續(xù)處于高水平，移植組大鼠血糖隨時間變化均有下降，尤其以移植組D大鼠血糖下降最為明顯。
　　2．腹腔糖耐量試驗顯示，正常組大鼠血糖在注射葡萄糖后30min達高峰，120min時下降到正常水平；假手術組大鼠血糖在注射葡萄糖后呈現(xiàn)持續(xù)升高