GM1聯合生長因子誘導人骨髓間充質干細胞分化為神經元樣細胞的研究.pdf

1、目的:骨髓間充質干細胞(BMSCs)是一群能不斷自我更新、分裂增殖，且具多譜系分化潛能的多能干細胞。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)能有效促進 BMSCs向神經元樣細胞分化，且對細胞幾乎無毒副作用。單唾液酸四己糖神經節(jié)苷脂(GM1)是神經細胞質膜的重要組成成分，對神經細胞分化和成熟過程必不可少，并可保護和修復受損神經細胞。本研究旨在探討GM1聯合生長因子(bFGF+EGF)能否更為高效地促進 BMSCs分化為神

2、經元樣細胞，從而為細胞替代治療神經系統(tǒng)變性疾病提供實驗依據。
　　方法:采用密度梯度離心法獲取骨髓單個核細胞，行原代、傳代培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)變化和生長情況；取第3代 BMSCs，用流式細胞術鑒定其表面標志物(CD29、CD105、CD34、CD45)；同時鑒定其多分化潛能。將第3代 BMSCs分四組向神經元樣細胞誘導分化，A組：單用生長因子(bFGF+EGF)；B組：單用 GM1；C組：GM1聯合生長因子(bFGF+EGF)；D組

3、：對照組。分別在正式誘導前、后行免疫細胞化學法檢測各組細胞 Nestin、β-TubulinⅢ、GFAP的陽性表達率并用 SPSS18.0進行數據統(tǒng)計分析。
　　結果:骨髓單個核細胞接種于培養(yǎng)瓶24h后可見多數細胞已貼壁，48h首次全量換液，可見較多骨髓單個核細胞散在分布。原代培養(yǎng)5-6天可見散在分布的短梭形、多角形或寬大扁平形細胞而形成的集落；8-11天，細胞生長速度明顯加快，形態(tài)逐漸變成梭形；14-16天，細胞逐漸鋪滿培養(yǎng)瓶底

4、，可達80％-90%融合，呈漩渦狀分布；傳代后的細胞，形態(tài)與原代相似，但其生長潛伏期明顯縮短。流式細胞術鑒定第3代 BMSCs表面標志物呈 CD29(+)、CD105(+)、CD34(-)、CD45(-)；同時其具分化為成骨細胞和成脂細胞潛能。BMSCs誘導分化為神經元樣細胞之前，四組細胞 Nestin、β-Tubulin、GFAP表達均呈陰性；正式誘導2-4天，A、B、C三組 Nestin陽性細胞表達率均呈上升趨勢，且 C組高于A、B

5、、D組；正式誘導6-8天，A、B、C三組 Nestin陽性細胞表達率均有所降低，而β-TubulinⅢ、GFAP陽性細胞表達率則呈較明顯上升趨勢，且 C組較 A、B組升高明顯。綜合實驗數據，C組的Nestin、β-TubulinⅢ、GFAP陽性細胞表達率均高于A、B、D組。
　　結論:1.采用密度梯度離心法結合細胞貼壁培養(yǎng)法來分離、培養(yǎng) BMSCs，可獲得較高純度的BMSCs，且細胞活性較高，適用于進一步實驗研究。2. GM1聯合