GM1聯(lián)合生長因子誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的研究.pdf

1、目的:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一群能不斷自我更新、分裂增殖，且具多譜系分化潛能的多能干細(xì)胞。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)能有效促進(jìn) BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，且對細(xì)胞幾乎無毒副作用。單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)是神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜的重要組成成分，對神經(jīng)細(xì)胞分化和成熟過程必不可少，并可保護(hù)和修復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞。本研究旨在探討GM1聯(lián)合生長因子(bFGF+EGF)能否更為高效地促進(jìn) BMSCs分化為神

2、經(jīng)元樣細(xì)胞，從而為細(xì)胞替代治療神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:采用密度梯度離心法獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞，行原代、傳代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長情況；取第3代 BMSCs，用流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表面標(biāo)志物(CD29、CD105、CD34、CD45)；同時(shí)鑒定其多分化潛能。將第3代 BMSCs分四組向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化，A組：單用生長因子(bFGF+EGF)；B組：單用 GM1；C組：GM1聯(lián)合生長因子(bFGF+EGF)；D組

3、：對照組。分別在正式誘導(dǎo)前、后行免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組細(xì)胞 Nestin、β-TubulinⅢ、GFAP的陽性表達(dá)率并用 SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶24h后可見多數(shù)細(xì)胞已貼壁，48h首次全量換液，可見較多骨髓單個(gè)核細(xì)胞散在分布。原代培養(yǎng)5-6天可見散在分布的短梭形、多角形或?qū)挻蟊馄叫渭?xì)胞而形成的集落；8-11天，細(xì)胞生長速度明顯加快，形態(tài)逐漸變成梭形；14-16天，細(xì)胞逐漸鋪滿培養(yǎng)瓶底

4、，可達(dá)80％-90%融合，呈漩渦狀分布；傳代后的細(xì)胞，形態(tài)與原代相似，但其生長潛伏期明顯縮短。流式細(xì)胞術(shù)鑒定第3代 BMSCs表面標(biāo)志物呈 CD29(+)、CD105(+)、CD34(-)、CD45(-)；同時(shí)其具分化為成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞潛能。BMSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞之前，四組細(xì)胞 Nestin、β-Tubulin、GFAP表達(dá)均呈陰性；正式誘導(dǎo)2-4天，A、B、C三組 Nestin陽性細(xì)胞表達(dá)率均呈上升趨勢，且 C組高于A、B

5、、D組；正式誘導(dǎo)6-8天，A、B、C三組 Nestin陽性細(xì)胞表達(dá)率均有所降低，而β-TubulinⅢ、GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)率則呈較明顯上升趨勢，且 C組較 A、B組升高明顯。綜合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，C組的Nestin、β-TubulinⅢ、GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)率均高于A、B、D組。
　　結(jié)論:1.采用密度梯度離心法結(jié)合細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法來分離、培養(yǎng) BMSCs，可獲得較高純度的BMSCs，且細(xì)胞活性較高，適用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。2. GM1聯(lián)合