骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠重建陰道的影響.pdf

1、陰道重建術(shù)是解決先天畸形及后天疾病所致的無陰道患者性生活和性角色的主要方法。目前陰道重建的方法很多但尚無公認(rèn)一致的方法。理想的方法應(yīng)該既能形成結(jié)構(gòu)和功能均接近生理狀態(tài)的陰道以滿足患者的性生活的需求，又能盡量減少對自身組織的損傷。目前最常用的重建方法是在膀胱和直腸之間造穴并以各種不同的組織襯里覆蓋創(chuàng)面重建陰道，組織襯里的選擇在很大程度上決定了手術(shù)的效果，常用的組織襯里有腹膜，皮片，皮瓣，口腔黏膜、頭皮等自體組織及羊膜，胎兒皮膚等異體組織，

2、自體組織重建陰道給患者帶來新的創(chuàng)傷且存在自體取材受限的問題，異體組織又可能感染外源性疾病，均非理想的組織襯里材料，近年來隨著組織工程學(xué)的發(fā)展為陰道重建提供了新思路。
　　近年已有學(xué)者應(yīng)用組織工程支架材料做襯里為患者行陰道重建術(shù)，雖然應(yīng)用這些材料亦能成功的重建陰道，但是單純應(yīng)用這些材料術(shù)后陰道黏膜上皮化速度較慢，易出血，增加感染和術(shù)后陰道攣縮的機(jī)會。動物實驗研究已經(jīng)證實種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合后能促進(jìn)重建陰道各種組織成分的再生，可構(gòu)建

3、一個更接近生理狀態(tài)的陰道。目前用于陰道重建的種子細(xì)胞主要有陰道上皮細(xì)胞，陰道平滑肌細(xì)胞和肌源干細(xì)胞。雖然應(yīng)用這些細(xì)胞后可以更好的構(gòu)建組織工程陰道，但是這些細(xì)胞培養(yǎng)條件要求較高，不利于大量培養(yǎng)和臨床應(yīng)用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源充足，分離培養(yǎng)方法成熟，易于培養(yǎng)，有多向分化能力，旁分泌功能，免疫原性低，可用于自體和異體組織重建。已有研究證實骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞局部應(yīng)用促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，與小腸黏膜下基質(zhì)（SIS）復(fù)合后促進(jìn)重建組織的修復(fù)。SIS來源廣泛，

4、制作方法相對簡單，且含有多種生長因子，已被用于多種組織工程組織的構(gòu)建，是一種比較理想的支架材料，因此本研究嘗試用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞與SIS復(fù)合后重建陰道，探討其在陰道重建中的作用。
　　第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與SIS的復(fù)合及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記
　　目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與SIS的復(fù)合方法，優(yōu)化復(fù)合條件，選擇適合的標(biāo)記方法為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：制備SIS并用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察。用全骨

5、髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。（1）消化收集第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/ml、2×106/ml、1×106/ml。分別接種于96孔板中預(yù)濕后的SIS上（每個濃度12個孔每孔100μl），分別于復(fù)合后1,3,5,7天每天取3孔用MTT法檢測細(xì)胞活性，比較復(fù)合濃度及復(fù)合時間對復(fù)合效果的影響。（2）消化收集第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/ml、2×106/ml、1×106/ml，分別接種于96孔

6、板中預(yù)濕后SIS上（4×106/ml12個孔，2×106/ml21個孔，1×106/ml9個孔），24 h后首次換液，此后隔日換液一次，復(fù)合后第2天2×106/ml，1×106/ml濃度中的9個孔以相同細(xì)胞濃度重復(fù)接種一次，分別于復(fù)合后1,3,5,7天每天取3孔用MTT法檢測細(xì)胞活性，比較復(fù)合次數(shù)對復(fù)合效果的影響。（3）SIS用不同的預(yù)濕方法（新法，舊法）處理后，消化收集第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/ml、2×106

7、/ml分別接種于96孔板中兩種預(yù)濕方法處理后的SIS上（每個濃度，每種預(yù)濕方法3個孔），24 h后用MTT法檢測細(xì)胞活性，比較預(yù)處理方法對復(fù)合效果的影響。光學(xué)顯微鏡，掃描電鏡觀察復(fù)合情況。CM-Dil標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察標(biāo)記效果。
　　結(jié)果：制備的SIS光學(xué)顯微鏡下觀察無細(xì)胞殘留，掃描電鏡觀察見SIS漿膜面光滑，黏膜面粗糙。用全骨髓貼壁法成功的分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。（1）2×106/ml MSCs與SIS復(fù)

8、合后第一天粘附率最高（OD值為1.109±0.048）。（2）復(fù)合后同一時間，2×106/ml MSCs與SIS復(fù)合后的粘附率（OD值為0.548±0.044）不及1×106/ml MSCs與SIS分兩次復(fù)合后的粘附率（OD值為1.176±0.056），但兩次復(fù)合后1天的粘附率（OD值為1.176±0.056）并不比高濃度單次復(fù)合后1天的粘附率高（OD值為1.488±0.049），隨時間延長粘附率下降。（3）2×106/ml MSCs與

9、新法預(yù)處理的SIS復(fù)合后粘附率高（OD值為2.013±0.049 vs.1.684±0.156）。MSCs與SIS復(fù)合后光學(xué)顯微鏡下可見SIS黏膜面有較多細(xì)胞附著，漿膜面幾乎無細(xì)胞附著。掃描電鏡可見細(xì)胞附著在SIS表面，呈長梭形或不規(guī)則形狀，細(xì)胞表面可見顆粒狀物及微絨毛。以終濃度5μM的CM-DiI標(biāo)記細(xì)胞24小時后熒光顯微鏡觀察可見干細(xì)胞膜呈橙黃色，胞核不著色，標(biāo)記率幾乎達(dá)100％。
　　結(jié)論：新的預(yù)濕方法，MSCs以2×106

10、/ml的濃度（約5×105個/cm2）與SIS復(fù)合1天后粘附率最高。CM-DiI能成功的標(biāo)記MSCs，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠重建陰道的影響
　　目的：通過比較SIS和SIS復(fù)合MSCs后重建的大鼠陰道，探討MSCs對大鼠重建陰道的影響。
　　方法：44只雌性SD大鼠隨機(jī)分成2組，單純SIS組（SIS組）和MSCs復(fù)合SIS組（SIS+MSCs組）。手術(shù)切除大鼠陰道，分別將SIS和與MS

11、Cs復(fù)合后的SIS移植入切除陰道后形成的腔穴內(nèi)重建大鼠陰道。每組分別于術(shù)后2周，4周，12周隨機(jī)處死6只大鼠，取陰道全層進(jìn)行相關(guān)檢測，冰凍切片熒光顯微鏡下觀察陰道組織中的干細(xì)胞，石蠟切片HE染色，免疫組化SP法檢測新陰道組織中上皮，平滑肌及神經(jīng)的表達(dá)情況。每組剩余4只于12周處死用于組織浴槽檢測，先給予高濃度的K溶液（終濃度124 mM），陰道組織收縮說明組織活性好可以用于后續(xù)實驗，如果沒有收縮則棄用。依次給予不同濃度的去氧腎上腺素（終

12、濃度10-6,10-5,10-4 M），用酚妥拉明（10-4 M）阻斷后再次給予去氧腎上腺素（終濃度10-4 M）觀察陰道組織張力變化情況。給予不同的電場刺激（electrical field stimulation，EFS），刺激參數(shù)：單脈沖方波、波寬1ms，電壓30v，頻率為30，60，90Hz持續(xù)0.5s以及30，60，90Hz持續(xù)1s，觀察陰道組織的張力變化情況
　　結(jié)果：成功構(gòu)建兩組大鼠陰道重建模型。(1)新陰道的大體觀

13、察：2周：已不能分辨SIS，新陰道表面較薄，粉紅色，質(zhì)韌，無彈性。4周：新陰道表面增厚，粉白色，質(zhì)韌，無明顯彈性。12周：新陰道表面較光滑，粉白色，質(zhì)地較4周時軟，有一定的彈性。SIS+MSCs組比SIS組新陰道表面更光滑彈性更好，取材時發(fā)現(xiàn)SIS+MSCs組分離下來的新陰道比SIS組薄，軟，12周時更加明顯且彈性更好。(2)干細(xì)胞的示蹤：術(shù)后2周，4周，12周重建陰道組織中均可見橙黃色的MSCs，低倍鏡下可見橙黃色的MSCs主要分布在

14、深層組織中，表層少，高倍鏡下可見存活的MSCs胞核部位無熒光，DAPI染色后可見藍(lán)色胞核周圍包繞橙黃色熒光，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰。(3)重建陰道的組織學(xué)觀察：兩組重建陰道2周時均可見有部分上皮從陰道入口向上爬行，伴有炎細(xì)胞浸潤，SIS+MSCs組上皮的生長速度較SIS組快。4周時兩組上皮均能覆蓋整個陰道，SIS+MSCs組的炎細(xì)胞浸潤較SIS組少。12周時兩組上皮進(jìn)一步成熟，基底層可見釘狀突起，無明顯炎細(xì)胞浸潤，與正常陰道無明顯區(qū)別。(4)新生

15、上皮廣譜角蛋白AE1/AE3染色陽性，α-SMA免疫組化染色結(jié)果顯示新陰道4周時出現(xiàn)少量平滑肌組織，12周可見肌束形成，SIS+MSCs組多于SIS組。PGP9.5免疫組化染色結(jié)果顯示術(shù)后3個月皮下組織中可見少量神經(jīng)纖維，SIS+MSCs組多于SIS組，但是仍與正常陰道組織有明顯差異。(5)在組織浴槽實驗中給予10-6，10-5，10-4M去氧腎上腺素后陰道組織呈濃度依賴性的收縮，正常陰道， SIS組和SIS+MSCs組重建陰道的收縮強(qiáng)

16、度分別為高鉀溶液誘導(dǎo)的收縮強(qiáng)度的18.471%，81.753%，141.196%；63.354%，148.058%，170.243%和52.572%，165.558%，181.171%。三組陰道組織收縮反應(yīng)有明顯差異（P<0.001），進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)兩組重建陰道的收縮強(qiáng)度均明顯高于正常陰道，但兩組重建陰道之間比較無明顯差異。酚妥拉明阻斷后收縮強(qiáng)度減小，正常陰道，SIS組和SIS+MSCs組重建陰道的收縮強(qiáng)度分別為未阻斷時的39.77

17、7%，48.540%，40.466%，三組之間比較無明顯差異（P=0.672>0.05）。在30v,持續(xù)1s，頻率為30，60，90Hz的電場刺激下正常陰道，SIS組和SIS+MSCs組重建陰道組織的收縮強(qiáng)度分別為高鉀溶液誘導(dǎo)的收縮強(qiáng)度的113.732%，222.179%，254.331%；11.256%，18.214%，20.251%和28.348%，51.406%，57.535%，三組之間比較有明顯差異（P<0.001），進(jìn)一步兩兩

18、比較發(fā)現(xiàn)，雖然兩組重建陰道的收縮強(qiáng)度均明顯低于正常陰道，但SIS+MSCs組重建陰道的收縮強(qiáng)度明顯高于SIS組
　　結(jié)論：復(fù)合MSCs后能促進(jìn)重建陰道上皮，平滑肌和神經(jīng)的再生。重建陰道對去氧腎上腺素的反應(yīng)比正常陰道強(qiáng)，酚妥拉明阻斷后收縮強(qiáng)度的變化情況與正常陰道無明顯差別，提示再生平滑肌組織中腎上腺素能受體表達(dá)可能多于正常平滑肌。雖然兩組重建陰道的收縮強(qiáng)度均明顯低于正常陰道，但SIS+MSCs組重建陰道的收縮強(qiáng)度明顯高于SIS組，進(jìn)

19、一步證明MSCs能促進(jìn)重建陰道平滑肌的再生。
　　第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與SIS復(fù)合促進(jìn)大鼠重建陰道修復(fù)的機(jī)制
　　目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與SIS復(fù)合促進(jìn)大鼠重建陰道修復(fù)的機(jī)制
　　方法：免疫組化SP法檢測兩組重建陰道組織中的微血管密度（MVD）。免疫熒光法在檢測SIS+MSCs組重建陰道中的微血管的同時，觀察局部定植的干細(xì)胞與微血管的關(guān)系。RT-qPCR，western blot檢測重建陰道組織中VEGF mR

20、NA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）CD34陽性表達(dá)定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)或胞膜，用于標(biāo)記并計數(shù)MVD。術(shù)后2周SIS+MSCs組重建陰道組織中MVD值為36.347±4.054明顯高于SIS組重建陰道組織中的28.278±6.259（P=0.024＜0.05）。術(shù)后4周SIS+MSCs組重建陰道組織中MVD值明顯高于SIS組（31.325±6.064 vs.22.250±4.385，P=0.014＜0.05）。術(shù)后12周SIS

21、+MSCs組重建陰道組織中MVD值為25.347±4.077明顯高于SIS組的20.833±2.246（P=0.039＜0.05）。（2）組織中血管內(nèi)皮表達(dá)CD34呈綠色熒光，可見一些CM-Dil標(biāo)記的橙黃色MSCs位于血管周圍，但是MSCs并不表達(dá)CD34。（3）VEGF mRNA在SIS+MSCs組重建陰道組織中相對于SIS組的表達(dá)量術(shù)后2周為1.490±0.436；術(shù)后4周為1.562±0.375；術(shù)后12周為1.432±0.31

22、9，均明顯高于同期SIS組的表達(dá)量（2周，P=0.040＜0.05；4周，P=0.022＜0.05；12周，P=0.022＜0.05）。（4）術(shù)后2周SIS組和SIS+MSCs組重建陰道組織中VEGF蛋白的表達(dá)量分別為0.146和0.156，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.817>0.05)。術(shù)后4周SIS+MSCs組重建陰道組織中VEGF蛋白的表達(dá)量（0.156）明顯高于SIS組（0.104）（P=0.039＜0.05）。術(shù)后12周