骨髓間充質干細胞對大鼠鉗夾視神經損傷影響的初步探討.pdf

1、隨著社會經濟、交通的迅猛發(fā)展，顱腦創(chuàng)傷(Traumatic Brain Injury，TBI)的發(fā)生頻率逐年增加，極大地威脅人類的生命健康。顱腦創(chuàng)傷的患者大多數為青壯年，嚴重影響社會勞動力，給社會和家庭帶來沉重的經濟、精神負擔。
　　 顱腦創(chuàng)傷救治水平的不斷提高，人們越來越重視顱腦創(chuàng)傷合并傷的治療，以降低其死亡率和致殘率，提高患者生活質量。創(chuàng)傷性視神經損傷(traumatic optic neuropathy，TON)在顱腦損傷

2、患者中發(fā)病率約為0.5％～5％。視神經作為中樞神經系統(tǒng)的一部分(central nervous system，CNS)，因為對損傷非常敏感，并且缺乏雪旺氏細胞，自我修復能力較差，是顱腦外傷致殘率較高的一個重要原因。視神經損傷患者通常出現視力減退甚至失明，嚴重影響患者的生活、工作、學習等。創(chuàng)傷性視神經損傷的臨床救治尚無統(tǒng)一、療效確切的治療規(guī)范，是當今醫(yī)學界研究的熱點及難點。本課題以急性視神經損傷為研究對象，重點研究視神經損傷的病理生理變化

3、及骨髓間充質干細胞的神經修復功能，主要分為以下五個部分分別進行基礎研究和臨床觀察。
　　 第一部分：視神經鉗夾損傷模型建立和病理生理變化
　　 目的：成功建立視神經鉗夾損傷動物模型，研究急性視神經損傷后視網膜神經節(jié)細胞(RGCs)的凋亡的動態(tài)變化，探討GFAP在急性視神經損傷中的作用機理，為創(chuàng)傷性視神經損傷的臨床治療和預后判斷提供實驗依據。
　　 方法：應用外科手術顯微鏡，經眼入路，充分暴露視神經，使用20g動脈

4、瘤夾夾傷成年SD大鼠視神經9s，共40只，致傷側作為實驗致傷組，對側為自身對照組。20只成年SD大鼠隨機分為4組即正常組、損傷1w組，損傷2w組和損傷4w組。每只實驗大鼠均進行術前術后瞳孔直徑及對光反射檢測和手術前后閃光視覺誘發(fā)電位(F-VEP)的測定，觀察波峰振幅和潛伏期。各組動物灌注固定后取視神經和視網膜，行RGCs計數、HE染色和免疫組化檢查。
　　 結果：1、致傷組瞳孔直徑平均為3.05±0.32mm，直接光反射消失、間

5、接光反射靈敏；對照組為0.73±0.12mm，直接光反射靈敏、間接光反射消失。
　　 2、損傷后1w的HE染色，僅見少量炎性細胞，2w可見炎性細胞和少量血管增生，4w可見大量炎性細胞浸潤以及新生血管。
　　 3、損傷后3d，RGCs無明顯變化，損傷后3d，1、2、4w，RGCs數量明顯下降(p＜0.05)，分別下降約5.13％、27.88％、43.91％、60.58％。
　　 4、致傷后，損傷區(qū)域GFAP逐漸減退

6、；損傷周圍表達量增加，致傷后2w到達高峰，然后逐漸下降。
　　 結論：視神經鉗夾損傷模型穩(wěn)定性高、易操作、重復性好，可在實驗室內完成；此模型能夠有效的模擬臨床上創(chuàng)傷性視神經損傷的病理生理變化和臨床癥狀。
　　 第二部分：骨髓間充質干細胞的分離、鑒定和干細胞支架的構建
　　 目的：分離、純化、培養(yǎng)骨髓間充質干細胞并予以鑒定；構建骨髓間充質干細胞植入支架。
　　 方法：1、取大鼠股骨，使用PBS沖洗出骨髓，離

7、心并使用貼壁篩選法分離純化骨髓間充質干細胞，并將其傳代培養(yǎng)。運用流式細胞儀檢測骨髓間充質干細胞的陽性標志CD44、CD105，陰性標志CD45、CD34，以鑒定骨髓間充質干細胞的純度；2、以人工合成膠原蛋白為原料制作視神經鞘管，孔隙大約為150μm。細胞傳代后，將視神經鞘管放入細胞懸液中培養(yǎng)24h后激光共聚焦觀察。
　　 結果：1、骨髓間充質干細胞易于傳代培養(yǎng)，流式細胞儀檢測的結果，CD44、CD105、CD45、CD34分別為

8、91.23±2.1％、85.77±3.1％、1.25±1.1％、0.78±0.3％；2、激光共聚焦顯示視神經鞘管上滿布骨髓間充質干細胞。
　　 結論：運用大鼠骨髓腔易提取骨髓間充質干細胞，且其純度較高；以視神經鞘管為基礎，成功制備植入支架，能夠生長大量骨髓間充質干細胞。
　　 第三部分：骨髓間充質干細胞對視神經損傷的視網膜節(jié)細胞數量的影響
　　 目的：探討骨髓間充質干細胞對視神經損傷視網膜節(jié)細胞的影響，以及其RG

9、Cs的動態(tài)變化。
　　 方法：以大鼠視神經鉗夾傷模型為實驗對象，隨機分為骨髓間充質干細胞治療組、磷酸緩沖液(PBS)治療對照組和空白對照組(損傷后不予以治療)，每組各20只。視神經損傷后3d分別植入富含骨髓間充質干細胞或者磷酸緩沖液的視神經鞘管于損傷部位。治療后3d、1w、2w、4w，取材行RGCs計數并比較三組之間差異。
　　 結果：1、骨髓間充質干細胞治療組中分別在治療后3d、1w、2w、4w(4個亞組)取材，進行R

10、GCs計數，RGCs計數分別為242±9、225±6、208±11、138±12；磷酸緩沖液(PBS)治療對照組的4個亞組的RGCs計數分別為238±12、198±11、166±9、131±12；空白對照組分別為225±12、201±10、176±6、121±6。
　　 2、磷酸緩沖液組與空白對照組之間各亞組之間的RGCs的計數均無明顯差異。
　　 3、骨髓間充質干細胞治療組和磷酸緩沖液治療組或空白對照組之間，在治療后3

11、d和4w，在RGCs計數方面無明顯差異；在治療后1w和2w，在RGCs計數方面存在差異，P＜0.05。
　　 結論：骨髓間充質干細胞的移植可以減緩視網膜節(jié)細胞的凋亡，具有一定RGCs保護作用，抵抗凋亡。
　　 第四部分：骨髓間充質干細胞對視神經損傷的病理結構的影響
　　 目的：探討骨髓間充質干細胞對視神經損傷病理結構的影響，及其相關影響因素。
　　 方法：以成功建立的大鼠視神經鉗夾傷模型和骨髓間充質干細胞

12、支架為基礎，把成年SD大鼠隨機分為骨髓間充質干細胞治療組、磷酸緩沖液(PBS)治療對照組和空白對照組(損傷后不予以治療)，每組各20只。視神經損傷后3d分別植入富含骨髓間充質干細胞或者磷酸緩沖液的視神經鞘管于損傷部位。治療后3d、1w、2w、4w取材行免疫組化(GFAP)、透射電鏡檢測并比較三組之間差異。運用PTEN、P-EGFR抗體，分別對正常、損傷后1w、損傷1w后治療的大鼠進行免疫組化檢測。
　　 結果：1、骨髓間充質干細

13、胞治療組中分別在治療后3d、1w、2w、4w(4個亞組)取材檢測，損傷區(qū)域及周圍均出現GFAP的表達量逐漸增加，治療后2w到達高峰，4w后基本無表達；磷酸緩沖液治療與空白對照組GFAP的表達無明顯差異，免疫組化顯示損傷區(qū)域無表達，損傷周圍隨著時間的推移表達量逐漸增加，至2w到達高峰，4w后表達陰性；
　　 2、PTEN：在視神經和視網膜節(jié)細胞均可表達，正常組低表達，損傷組高表達，治療組低表達；P-EGFR：正常陰性，致傷后損傷區(qū)

14、域低表達、周圍高表達，治療后損傷區(qū)域表達增加。
　　 3、透射電鏡顯示各亞組，隨著時間的推移，正常軸突數目逐漸減少，髓板愈加松散，脫髓鞘明顯。透射電鏡顯示治療后3d損傷區(qū)域可見輕度脫髓鞘，髓板輕度松散，隨著時間的推移，出現明顯的脫髓鞘病變，髓鞘泡狀分離，線粒體腫脹、溶解，板層分離等，至4w，出現更加明顯的髓鞘崩解。
　　 結論：骨髓間充質干細胞的移植具有一定的神經保護作用，延緩脫髓鞘病變，并且有利于視神經髓鞘的修復。

15、r>　　 第五部分：創(chuàng)傷性視神經損傷的臨床觀察
　　 目的：分析創(chuàng)傷性視神經損傷的手術治療和保守治療的效果，探討創(chuàng)傷性視神經損傷的臨床治療方法，并進一步探討創(chuàng)傷性視神經損傷的手術技巧和預后情況。
　　 方法：回顧性分析本人在上海市長征醫(yī)院神經外科學習期間參與診治的4例(5只眼)創(chuàng)傷性視神經損傷患者的臨床資料，平均隨訪6個月(3個月-2年)。
　　 結果：病例一：男，52歲，車禍至頭部外傷，左眼僅有光感，眼眶CT

16、(平掃)提示雙側眼視神經管骨折，骨折片壓迫視神經。入院后5日全麻下經額外側入路行左側視神經管減壓手術，隨訪至第六個月患者左眼視力恢復至40/200；病例二：男，23歲，車禍至頭部外傷三小時入院，GCS8(E1V2M5)，右側瞳孔散大，直接對光反射消失，間接對光反射存在。眼眶CT右側視神經管、眶上裂未見骨折，考慮視神經水腫。全麻下行以傷口為手術切口，經眶上鎖孔入路行視神經管減壓術?；佳坌g后第一天即出現微弱的直接對光反射，2周后恢復至正常；

17、病例三：男，22歲，車禍至頭部外傷3天，由外院轉入院，查體GCS13(E3V4M6)，左側瞳孔5mm，直接光反射消失，直接光反射消失、間接光感反射靈敏。眼眶CT(平掃+三維重建)提示左側視神經管骨折，管腔擴大，視神經無明顯壓迫。保守治療，靜脈予以大劑量激素沖擊+神經營養(yǎng)藥，三天后激素逐漸減量，后改口服維持2周。1月后患眼視力逐漸恢復至正常；病例四：女，48歲，車禍至頭部外傷1月，入院查體GCS15分，雙眼無光感，瞳孔擴大，左眼直徑約4m