食用菌提取物體外降血糖活性篩選模型的建立及活性化合物作用機制的研究.pdf

1、食用菌是一類營養(yǎng)豐富且無毒副作用的天然食品資源，大量研究表明靈芝、桑黃、北蟲草等食藥用菌具有明顯的降血糖效果。II型糖尿病的主要病征包括胰島素抵抗、胰島素分泌相對不足和血糖過高幾方面，血糖高于正常水平可由前兩種因素或多種因素造成：如二肽基肽酶IV降解腸促胰島素激素GLP-1導(dǎo)致GLP-1無法刺激小腸或結(jié)腸分泌腸胰島素；或胰島β細(xì)胞受到損傷而選擇性凋亡，導(dǎo)致無法分泌足量胰島素；胰島素信號通路被阻礙導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗；細(xì)胞糖代謝過程的關(guān)

2、鍵酶失活導(dǎo)致細(xì)胞對葡萄糖的攝取利用速度減慢。本論文基于以上幾方面分別研究了食用菌提取物及桑黃菌絲體化合物的降血糖活性，并對3種菌絲體化合物原兒茶醛、柚皮素和黃芩素的降血糖作用機制進行了初步探討。
　　研究主要內(nèi)容如下：
　　1.建立細(xì)胞來源的二肽基肽酶Ⅳ抑制劑篩選模型通過底物顯色法并對九種食用菌（桑黃、靈芝、香菇、杏鮑菇、雞腿菇、灰樹花、猴頭、姬松茸和蛹蟲草）醇提物、桑黃和靈芝的四種有機溶劑（正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚）

3、萃取物、桑黃子實體和菌絲體分離純化的化合物抑制CHO細(xì)胞源性DPPIV活性的效果進行了研究。以H-Gly-pNA?HCl為反應(yīng)底物，通過底物顯色法檢測CHO細(xì)胞來源DPPIV的活性，優(yōu)化的篩選模型條件為底物濃度90mmol/L、顯色時間60 min、溫度37℃、pH7.6，陽性對照藥物Ile-Pro-Ile的最佳作用濃度5mmol/L。利用此模型檢測供試樣品抑制CHO細(xì)胞源性DPPIV活性結(jié)果表明，桑黃和靈芝的抑制效果明顯好于其他7種食

4、用菌；桑黃及靈芝的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等四種萃取相在10和400μg/mL濃度均具有一定抑制效果，其中桑黃及靈芝的乙酸乙酯相抑制效果均好于其他萃取相。對桑黃子實體和菌絲體中分離化合物的DPPIV抑制作用進行了研究，子實體化合物wn-1（麥角甾-7,22-二烯-3β-醇十五酸酯）和wn-3（麥角甾-7,-二烯-3β-醇）DPPIV抑制效果最佳，菌絲體化合物中原兒茶醛、柚皮素和黃芩素的DPPIV抑制效果遠高于其他化合物。
　

5、　2.在底物顯色法DPPIV抑制劑篩選模型的基礎(chǔ)上，進行了檢測方法的改進。利用熒光顯色法建立細(xì)胞來源的DPPIV抑制劑篩選模型，并對九種食用菌醇提物、桑黃和靈芝的四種有機溶劑萃取物、桑黃分離純化的化合物抑制CHO細(xì)胞源性DPPIV活性的效果進行了研究。以Gly-Pro-PNA為反應(yīng)底物，通過熒光底物法檢測CHO（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）細(xì)胞來源DPPIV的活性，優(yōu)化的篩選模型條件為底物濃度70 mmol/L、溫度37℃、pH8.2，陽性對照藥

6、物Ile-Pro-Ile的最佳作用濃度1 mmol/L。熒光底物法DPPIV抑制活性檢測結(jié)果與底物顯色法基本一致，桑黃和靈芝醇提物，桑黃和靈芝的乙酸乙酯相，子實體化合物wn-1（麥角甾-7,22-二烯-3β-醇十五酸酯）和wn-3（麥角甾-7,-二烯-3β-醇），菌絲體化合物原兒茶醛、柚皮素和黃芩素都有較好的DPPIV抑制活性。相對于底物顯色法，熒光底物法避免了有色樣品的顏色干擾，因此結(jié)果更加精確。
　　3.利用此模型檢測供試樣品

7、抑制CHO細(xì)胞源性DPPIV活性結(jié)果表明，桑黃和靈芝的抑制效果明顯好于其他7種食用菌；桑黃及靈芝的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等四種萃取相在10和400μg/mL濃度均具有一定抑制效果，其中桑黃及靈芝的乙酸乙酯相抑制效果均好于其他萃取相。在化合物的DPPIV抑制率測定中，子實體化合物wn-1（麥角甾-7,22-二烯-3β-醇十五酸酯）和wn-3（麥角甾-7,-二烯-3β-醇）DPPIV抑制效果高于其他化合物，其他化合物也都具有一定的D

8、PPIV抑制效果；菌絲體化合物中樣品6（原兒茶醛）、樣品9（柚皮素）、樣品10（黃芩素）的DPPIV抑制效果最佳。
　　4.以高胰島素誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞和地塞米松誘導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞兩種胰島素抵抗細(xì)胞模型分別對九種食用菌醇提物、桑黃和靈芝的四種有機溶劑萃取物的體外降糖活性進行了研究。HepG2模型研究結(jié)果表明，九種食用菌醇提物中靈芝和桑黃醇提物促進細(xì)胞葡萄糖消耗效果最好，并且兩者高濃度組的葡萄糖消耗量均好于陽性對照組；桑黃

9、三種有機溶劑萃取相（正丁醇相、乙酸乙酯相和石油醚相）和靈芝四種有機溶劑萃取相促進細(xì)胞葡萄糖消耗效果較好，均好于陽性對照組。3T3-L1細(xì)胞模型結(jié)果表明，九種食用菌醇提物中靈芝和桑黃醇提物的促進葡萄糖消耗效果最好，均好于陽性對照組;靈芝及桑黃四種有機溶劑萃取相中，乙酸乙酯萃取相的葡萄糖消耗效果較好。
　　5.利用胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型篩選具有降血糖活性的桑黃菌絲體分離化合物，并對其作用機理進行了初步探討。研究結(jié)果表明原兒茶醛、

10、柚皮素和黃芩素三種化合物對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量具有明顯的促進作用，并且在三種化合物中，原兒茶醛和黃芩素分別對SOCS3因子和TNF-α因子表達的抑制作用最強。
　　6.研究了三種桑黃菌絲體化合物原兒茶醛、柚皮素和黃芩素對胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖代謝過程的關(guān)鍵酶己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)和α-葡萄糖苷酶酶活性的影響。結(jié)果表明原兒茶醛能明顯提升己糖激酶酶活，黃芩素能明顯提升丙酮酸激酶酶活，但三種化合物基本不具有明顯的