輪狀病毒NSP1抑制天然免疫機(jī)制及其對(duì)宿主蛋白調(diào)控的研究.pdf

1、輪狀病毒(Rotavirus，RV)是導(dǎo)致5歲以下嬰幼兒急性腹瀉的最主要病原，每年導(dǎo)致60萬(wàn)人死亡，嚴(yán)重危害人類健康，目前其致病機(jī)制尚不清楚。闡明RV的致病機(jī)制，尤其是其逃逸宿主免疫防御機(jī)理，將為新型抗RV策略及疫苗的研發(fā)提供依據(jù)。
　　 RV非結(jié)構(gòu)蛋白1(NSP1)在RV拮抗宿主天然免疫應(yīng)答中起重要作用，其功能尚不完全清楚。目前的研究表明，NSP1蛋白可以通過(guò)介導(dǎo)干擾素調(diào)控因子(IRF)家族蛋白的降解，以及通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子(

2、NF-κB)的活化來(lái)阻斷干擾素(IFN)信號(hào)通路，從而拮抗宿主抗病毒應(yīng)答。然而，有證據(jù)表明不同種屬來(lái)源RV NSP1同源性較低，而且不同NSP1蛋白與天然免疫的作用方式可能存在差異，如豬RV OSU株NSP1蛋白的IRF結(jié)合結(jié)構(gòu)域并不能介導(dǎo)IRF蛋白的降解。這提示不同來(lái)源NSP1可能通過(guò)多種途徑拮抗宿主天然免疫。鑒此，本研究擬進(jìn)一步探索NSP1與IFN信號(hào)通路相互作用的靶點(diǎn)，深入探討NSP1拮抗宿主天然免疫機(jī)理，并通過(guò)差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

3、，分析NSP1的表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞蛋白的調(diào)控，以期深入了解NSP1的功能。
　　 一、NSP1拮抗宿主天然免疫機(jī)理研究
　　 首先我們觀察到已知通過(guò)降解IRF抑制IFN應(yīng)答的RV毒株的NSP1在缺失IRF結(jié)合功能結(jié)構(gòu)域后，仍可以抑制IFN-β啟動(dòng)子活性，提示NSP1存在其它拮抗IFN作用靶點(diǎn)。免疫沉淀分析發(fā)現(xiàn)NSP1可以與維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)結(jié)合，并降低RIG-Ⅰ蛋白表達(dá)，而且人、猴、豬等不同種屬來(lái)源的RV NSP

4、1均可以下調(diào)RIG-Ⅰ。在RV感染時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)隨著病毒復(fù)制增加，RIG-Ⅰ也出現(xiàn)表達(dá)量的變化，感染后4h RIG-Ⅰ表達(dá)增加，而從感染后12h開(kāi)始RIG-Ⅰ表達(dá)逐漸減少，提示RIG-Ⅰ在RV感染中確實(shí)被抑制。NSP1擁有RING結(jié)構(gòu)域，但是否具有泛素連接酶活性尚未被直接證實(shí)。我們證實(shí)NSP1為泛素E3連接酶，可以增強(qiáng)細(xì)胞泛素化及自身泛素化，并且泛素連接酶功能與N端RING結(jié)構(gòu)域相關(guān)。但是NSP1對(duì)RIG-Ⅰ的抑制作用可能不是通過(guò)泛素-蛋

5、白酶體途徑。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明，RIG-Ⅰ中擁有Caspase1的切割位點(diǎn)，RIG-Ⅰ是否通過(guò)激活Caspase1切割RIG-Ⅰ拮抗其作用尚需要進(jìn)一步研究。
　　 作為模式識(shí)別受體，RIG-Ⅰ在機(jī)體監(jiān)測(cè)入侵RV并啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮了極其重要的作用，本研究首次發(fā)現(xiàn)了NSP1可以減少RIG-Ⅰ蛋白表達(dá)，以拮抗宿主IFN應(yīng)答，該研究結(jié)果揭示RIG-Ⅰ為NSP1作用新靶點(diǎn)，進(jìn)一步豐富了對(duì)于RV逃逸宿主天然免疫機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
　　

6、 二、NSP1對(duì)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)組的影響
　　 為了進(jìn)一步闡明NSP1的作用機(jī)制，我們利用熒光差異凝膠電泳(DIGE)技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜鑒定研究了過(guò)表達(dá)NSP1蛋白對(duì)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)組的影響。過(guò)表達(dá)NSP1后，初步鑒定到12個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中4個(gè)表達(dá)上調(diào)，8個(gè)表達(dá)下調(diào)。通過(guò)Western blot分析，我們對(duì)表達(dá)下調(diào)差異蛋白質(zhì)Prohibitin、ERP29進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果與DIGE結(jié)果一致。Gene Ontology分析顯示差異表

7、達(dá)蛋白涉及細(xì)胞骨架、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子伴侶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等功能。隨后我們研究了表達(dá)上調(diào)的波形蛋白(Vimentin)和NSP1相互作用。免疫熒光顯示RV感染后，波形蛋白細(xì)胞定位發(fā)生重新排列，提示波形蛋白可能與病毒復(fù)制和裝配有關(guān)。進(jìn)而我們利用激光共聚焦方法觀察了轉(zhuǎn)染NSP1后波形蛋白細(xì)胞定位變化，結(jié)果顯示，不表達(dá)NSP1蛋白的細(xì)胞中，波形蛋白成網(wǎng)狀纖維分布，而表達(dá)NSP1的細(xì)胞中，波形蛋白形成聚集體，并與NSP1蛋白共定位，提示NSP1蛋白表達(dá)可