SOSS1和ZNHIT1-SRCAP參與同源重組修復的分子機制研究.pdf

1、由于受到內源因素（如自身代謝產物、DNA堿基異構互變等）和外界環(huán)境（如電離輻射、紫外線、重金屬等）的影響，基因組遭受復雜多樣的損傷。根據受損傷DNA的特點，將DNA損傷分為單鏈斷裂、雙鏈斷裂、鏈內和鏈間交聯(lián)、嘧啶二聚體生成、堿基錯配等類型。DNA雙鏈斷裂損傷(DNA double-strand break，DSB)是最具危害的損傷類型之一，可導致基因重排、染色體丟失、融合或移碼、細胞死亡以及包括癌癥在內的遺傳性疾病的發(fā)生。DSB損傷的主

2、要修復機制包括同源重組(homologous recombination，HR)修復和非同源末端連接(nonhomologous end joining，NHEJ)修復。NHEJ是低保真的修復方式，它無需同源的DNA做模板而直接將斷裂的DSB末端相連，因此很可能導致DNA的部分丟失。HR是高保真的修復方式，主要發(fā)生在S/G2期。此時，細胞內的同源姐妹染色單體為受損傷DNA提供同源模板，從而保證了基因組的穩(wěn)定性和完整性。DNA末端切割是H

3、R通路的第一步，也是DSB修復選擇HR或NHEJ的重要抉擇點。首先，MRN復合物和CtIP參與DNA的末端切割，產生一段3'的ssDNA末端。單鏈DNA結合蛋白RPA迅速結合到該ssDNA上，通過招募ATRIP-ATR復合物到損傷位點激活ATR，從而引起細胞周期阻滯。然后，RAD51重組酶在BRCA1、BRCA2、PALB2及RAD51 paralogs等介導因子的作用下置換RPA，形成RAD51-ssDNA復合物結構，從而引導著ssD

4、NA尋找同源模板并進行鏈交換反應，形成D-loop結構。最后，ssDNA以同源的DNA為模板合成DNA，形成dHJ(double Holliday Junction)中間產物，在拆分復合物BLM-TopoⅢα-RMI1-RMI2的作用下對dHJ結構進行拆分，形成非交叉產物(noncrossover product)，完成雙鏈斷裂DNA的修復。
　　單鏈DNA結合蛋白(single-stranded DNA binding prot

5、eins，SSBs)能夠保護ssDNA免于核酸水解命運、防止DNA發(fā)卡結構形成、阻止互補的ssDNA重新退火成雙鏈DNA結構，從而參與DNA的復制、重組、修復等一系列DNA代謝過程，并且保證了DNA的順利加工和生物體遺傳物質的穩(wěn)定性。在高等生物中，SOSS1復合物及RPA復合物是參與DNA損傷修復的主要單鏈DNA結合蛋白。因此，我們研究SOSS1復合物及RPA復合物促進HR修復的分子機制及其調控過程。
　　SOSS1復合物由SOS

6、SA、SOSSB1和SOSSC三個亞基組成，識別并結合單鏈DNA，促進DSB損傷后的HR修復。相比于RPA復合物，SOSS1復合物研究較晚且分子機制有待完善。我們從結構生物學角度解析由SOSSA的N端(SOSSAN)與SOSSB1、SOSSC組成的復合物SOSS1N的晶體結構，并從分子生物學角度深入研究SOSS1復合物各亞基組裝的分子機制。我們發(fā)現(xiàn):(1)SOSSA作為支架蛋白介導了SOSS1復合物的組裝，并且維持了其它亞基的穩(wěn)定性;(

7、2)SOSSA保證了SOSS1復合物的其它亞基在細胞核的定位;(3)SOSSB1是識別單鏈DNA的關鍵組分，它利用不同的蛋白表面分別參與SOSS1復合物的裝配和單鏈DNA的結合。而且，我們通過定點突變技術進一步發(fā)現(xiàn)介導SOSSA與SOSSB1、SOSSC結合的關鍵氨基酸位點以及SOSSB1參與結合ssDNA的氨基酸位點，將這些位點突變后導致HR修復效率降低及IR損傷后細胞存活率下降，從而證明了SOSS1在DSB修復中的重要作用。

8、　　RPA復合物作為單鏈DNA結合蛋白幾乎參與真核生物DNA的所有代謝活動，而且作為感應蛋白能檢測DNA受損傷的信號從而激活DNA損傷檢驗點，最終有效地維持生物體基因組的穩(wěn)定性。HR修復中，RPA復合物能迅速結合DNA末端切割產生的ssDNA，促進RAD51-ssDNA引導的鏈入侵過程，但是RPA復合物被招募到DNA損傷位點的分子機制并不清楚。由于染色質的高度緊密折疊，DNA雙鏈斷裂損傷后參與DNA末端切割的MRN復合物和CtIP不能有

9、效的被招募到DSB損傷位點。SRCAP是ATP依賴的染色質重塑酶，屬于INO80家族。研究表明，SRCAP突變是導致Floating-Harbor syndrome遺傳綜合征的主要原因。我們發(fā)現(xiàn):SRCAP/ZNHIT1作為染色質重塑復合物參與DSB損傷后的染色質松弛，從而克服了染色質結構的緊密性，促進CtIP被招募到DNA損傷位點。該過程促進了DNA的末端切割，從而使得RPA復合物被招募到ssDNA上，最終促進HR修復。因此，我們創(chuàng)新