SOSS1和ZNHIT1-SRCAP參與同源重組修復(fù)的分子機(jī)制研究.pdf

1、由于受到內(nèi)源因素（如自身代謝產(chǎn)物、DNA堿基異構(gòu)互變等）和外界環(huán)境（如電離輻射、紫外線、重金屬等）的影響，基因組遭受復(fù)雜多樣的損傷。根據(jù)受損傷DNA的特點(diǎn)，將DNA損傷分為單鏈斷裂、雙鏈斷裂、鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)、嘧啶二聚體生成、堿基錯(cuò)配等類型。DNA雙鏈斷裂損傷(DNA double-strand break，DSB)是最具危害的損傷類型之一，可導(dǎo)致基因重排、染色體丟失、融合或移碼、細(xì)胞死亡以及包括癌癥在內(nèi)的遺傳性疾病的發(fā)生。DSB損傷的主

2、要修復(fù)機(jī)制包括同源重組(homologous recombination，HR)修復(fù)和非同源末端連接(nonhomologous end joining，NHEJ)修復(fù)。NHEJ是低保真的修復(fù)方式，它無需同源的DNA做模板而直接將斷裂的DSB末端相連，因此很可能導(dǎo)致DNA的部分丟失。HR是高保真的修復(fù)方式，主要發(fā)生在S/G2期。此時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的同源姐妹染色單體為受損傷DNA提供同源模板，從而保證了基因組的穩(wěn)定性和完整性。DNA末端切割是H

3、R通路的第一步，也是DSB修復(fù)選擇HR或NHEJ的重要抉擇點(diǎn)。首先，MRN復(fù)合物和CtIP參與DNA的末端切割，產(chǎn)生一段3'的ssDNA末端。單鏈DNA結(jié)合蛋白R(shí)PA迅速結(jié)合到該ssDNA上，通過招募ATRIP-ATR復(fù)合物到損傷位點(diǎn)激活A(yù)TR，從而引起細(xì)胞周期阻滯。然后，RAD51重組酶在BRCA1、BRCA2、PALB2及RAD51 paralogs等介導(dǎo)因子的作用下置換RPA，形成RAD51-ssDNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)，從而引導(dǎo)著ssD

4、NA尋找同源模板并進(jìn)行鏈交換反應(yīng)，形成D-loop結(jié)構(gòu)。最后，ssDNA以同源的DNA為模板合成DNA，形成dHJ(double Holliday Junction)中間產(chǎn)物，在拆分復(fù)合物BLM-TopoⅢα-RMI1-RMI2的作用下對(duì)dHJ結(jié)構(gòu)進(jìn)行拆分，形成非交叉產(chǎn)物(noncrossover product)，完成雙鏈斷裂DNA的修復(fù)。
　　單鏈DNA結(jié)合蛋白(single-stranded DNA binding prot

5、eins，SSBs)能夠保護(hù)ssDNA免于核酸水解命運(yùn)、防止DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成、阻止互補(bǔ)的ssDNA重新退火成雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，從而參與DNA的復(fù)制、重組、修復(fù)等一系列DNA代謝過程，并且保證了DNA的順利加工和生物體遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。在高等生物中，SOSS1復(fù)合物及RPA復(fù)合物是參與DNA損傷修復(fù)的主要單鏈DNA結(jié)合蛋白。因此，我們研究SOSS1復(fù)合物及RPA復(fù)合物促進(jìn)HR修復(fù)的分子機(jī)制及其調(diào)控過程。
　　SOSS1復(fù)合物由SOS

6、SA、SOSSB1和SOSSC三個(gè)亞基組成，識(shí)別并結(jié)合單鏈DNA，促進(jìn)DSB損傷后的HR修復(fù)。相比于RPA復(fù)合物，SOSS1復(fù)合物研究較晚且分子機(jī)制有待完善。我們從結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度解析由SOSSA的N端(SOSSAN)與SOSSB1、SOSSC組成的復(fù)合物SOSS1N的晶體結(jié)構(gòu)，并從分子生物學(xué)角度深入研究SOSS1復(fù)合物各亞基組裝的分子機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn):(1)SOSSA作為支架蛋白介導(dǎo)了SOSS1復(fù)合物的組裝，并且維持了其它亞基的穩(wěn)定性;(

7、2)SOSSA保證了SOSS1復(fù)合物的其它亞基在細(xì)胞核的定位;(3)SOSSB1是識(shí)別單鏈DNA的關(guān)鍵組分，它利用不同的蛋白表面分別參與SOSS1復(fù)合物的裝配和單鏈DNA的結(jié)合。而且，我們通過定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)SOSSA與SOSSB1、SOSSC結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)以及SOSSB1參與結(jié)合ssDNA的氨基酸位點(diǎn)，將這些位點(diǎn)突變后導(dǎo)致HR修復(fù)效率降低及IR損傷后細(xì)胞存活率下降，從而證明了SOSS1在DSB修復(fù)中的重要作用。

8、　　RPA復(fù)合物作為單鏈DNA結(jié)合蛋白幾乎參與真核生物DNA的所有代謝活動(dòng)，而且作為感應(yīng)蛋白能檢測DNA受損傷的信號(hào)從而激活DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)，最終有效地維持生物體基因組的穩(wěn)定性。HR修復(fù)中，RPA復(fù)合物能迅速結(jié)合DNA末端切割產(chǎn)生的ssDNA，促進(jìn)RAD51-ssDNA引導(dǎo)的鏈入侵過程，但是RPA復(fù)合物被招募到DNA損傷位點(diǎn)的分子機(jī)制并不清楚。由于染色質(zhì)的高度緊密折疊，DNA雙鏈斷裂損傷后參與DNA末端切割的MRN復(fù)合物和CtIP不能有

9、效的被招募到DSB損傷位點(diǎn)。SRCAP是ATP依賴的染色質(zhì)重塑酶，屬于INO80家族。研究表明，SRCAP突變是導(dǎo)致Floating-Harbor syndrome遺傳綜合征的主要原因。我們發(fā)現(xiàn):SRCAP/ZNHIT1作為染色質(zhì)重塑復(fù)合物參與DSB損傷后的染色質(zhì)松弛，從而克服了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的緊密性，促進(jìn)CtIP被招募到DNA損傷位點(diǎn)。該過程促進(jìn)了DNA的末端切割，從而使得RPA復(fù)合物被招募到ssDNA上，最終促進(jìn)HR修復(fù)。因此，我們創(chuàng)新