AML1-ETO融合基因相關(guān)白血病中EEN基因參與的分子發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、t（8；21）（q21；q22）是急性髓系白血病中常見的染色體易位，這種易位主要導(dǎo)致AML1-ETO融合基因的產(chǎn)生以及AML-M2的發(fā)生，約占AML-M2b的90％。EEN基因則是作為MLL基因的融合伙伴基因在一例急性單核細(xì)胞白血病病人中首次克隆。在MLL-EEN融合蛋白中，保留了大部分的EEN蛋白。相關(guān)的研究表明，MLL基因的融合伙伴基因?qū)LL融合基因的致白血病作用是必須的，這說(shuō)明，融合伙伴EEN在白血病發(fā)生中至關(guān)重要。在本研究中，

2、篩選了不同細(xì)胞株中EEN的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)EEN在Kasumi-1細(xì)胞中的表達(dá)比其他細(xì)胞株有明顯的升高。于是比較了攜帶不同融合基因的白血病患者骨髓cDNA中EEN的表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)具有AML1-ETO融合基因的M2b患者的EEN的表達(dá)量也有上調(diào)。繼而，在松甾酮A（PA）誘導(dǎo)表達(dá)AML1-ETO的U937細(xì)胞株中，通過RT-PCR和Western證實(shí)，EEN的RNA和蛋白質(zhì)水平都隨著AML1-ETO的誘導(dǎo)表達(dá)而升高。為了研究AML1-ETO與E

3、EN之間的調(diào)控關(guān)系以及在白血病發(fā)生過程中的作用，分析了EEN基因的啟動(dòng)子和相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。首先利用RNA酶保護(hù)試驗(yàn)確定了EEN基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于ATG起始密碼子上游144bp處。通過對(duì)EEN啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄元件分析，找到了Sp1和一個(gè)AML1的潛在的結(jié)合位點(diǎn)（TGCGGT）。隨后，利用染色質(zhì)免疫共沉淀證實(shí)AML1-ETO可以通過這一結(jié)合位點(diǎn)與EEN的啟動(dòng)子結(jié)合。通過這一結(jié)合，AML1-ETO可以異常激活EEN基因的轉(zhuǎn)錄，而AM

4、L1則沒有這個(gè)作用。由于過表達(dá)的AML1不具有激活EEN基因的功能，所以，說(shuō)明其他的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)EEN的表達(dá)發(fā)揮了主要作用。這樣通過EMSA和轉(zhuǎn)錄報(bào)告試驗(yàn)研究了Sp1對(duì)EEN基因的調(diào)控，證實(shí)Sp1可以結(jié)合到EEN的啟動(dòng)子區(qū)，并顯著激活EEN基因的轉(zhuǎn)錄。 EEN基因在染色體上與CAF1基因呈頭對(duì)頭的排列方式，所以，AML1-ETO可能可以調(diào)變CAF1基因的轉(zhuǎn)錄。發(fā)現(xiàn)，Sp1的結(jié)合位點(diǎn)序列與已知的絕緣子序列具有同源性。將該序列插入SV40的啟

5、動(dòng)子和增強(qiáng)子之間，通過報(bào)告試驗(yàn)證實(shí)該序列在EEN基因方向上，可以激活EEN基因的轉(zhuǎn)錄。而在CAF1基因方向上，該位點(diǎn)具有阻斷AML1-ETO對(duì)CAF1基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，發(fā)揮絕緣子的作用。RT-PCR的結(jié)果也顯示，在松甾酮A（PA）誘導(dǎo)表達(dá)AML1-ETO的U937細(xì)胞株中，CAF1基因的表達(dá)與AML1-ETO的含量沒有具體時(shí)相聯(lián)系。這說(shuō)明，該絕緣子在體內(nèi)具有活性。同時(shí)，在該誘導(dǎo)表達(dá)體系中，Sp1蛋白的含量沒有明顯的變化。同時(shí)，研究了E