降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)未成熟肺氧化應(yīng)激性損傷的保護(hù)作用及其Wnt7b-β-catenin信號(hào)機(jī)制.pdf

1、第一部分:不同濃度及時(shí)間氧暴露對(duì)未成熟鼠肺發(fā)育的影響
　　目的:研究不同濃度及時(shí)間氧暴露后早產(chǎn)鼠肺組織病理學(xué)、肺泡化程度及胎鼠原代AECII存活的情況，了解不同氧濃度及其作用時(shí)間對(duì)未成熟肺發(fā)育的影響。
　　方法:孕21 d SD早產(chǎn)鼠21％(空氣)、40％、60％、95％梯度濃度氧暴露不同時(shí)點(diǎn)光鏡觀察未成熟肺組織病理變化及肺泡化程度、酶標(biāo)儀測(cè)定肺組織MDA含量及TAOC；原代培養(yǎng)的SD胎鼠AECII制備上述梯度濃度氧細(xì)胞模型

2、，Annexin V/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞死亡，MTT法評(píng)估AECII增殖，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平，酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞TAOC。
　　結(jié)果:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)40％氧暴露后3 d、7 d、14 d早產(chǎn)鼠體質(zhì)量及體質(zhì)量增長(zhǎng)、存活率與空氣(常氧)對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，60％氧暴露組3 d、7 d、14 d各時(shí)點(diǎn)體質(zhì)量及體質(zhì)量增長(zhǎng)、存活率均明顯低于同時(shí)點(diǎn)空氣對(duì)照組(p<0.05)，95％氧暴露組體質(zhì)量及體質(zhì)量增長(zhǎng)、存活率降低程度更為顯著

3、(p<0.01)；光鏡下觀察空氣對(duì)照組及40％氧暴露組3 d、7 d、14 d肺組織未見(jiàn)病理改變，結(jié)構(gòu)清楚，肺泡大小均一，無(wú)炎性滲出，RAC值逐漸升高，60％氧暴露后7 d可見(jiàn)肺內(nèi)小血管充血，少量炎性改變，14 d時(shí)肺泡腔有所擴(kuò)張且RAC值與空氣對(duì)照組比較明顯降低(p<0.01)，95％氧暴露3 d即有肺小血管擴(kuò)張充血、炎性浸潤(rùn)，7 d時(shí)肺部炎癥更為明顯，14 d炎癥減輕，但肺泡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單化，7 d、14 d RAC值與同時(shí)點(diǎn)空氣對(duì)照組比

4、較明顯減少(p<0.01)；40％氧暴露組及空氣對(duì)照組肺組織MDA含量隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)沒(méi)有明顯變化，兩組間同時(shí)點(diǎn)MDA含量及TAOC無(wú)顯著差異，60％氧暴露組MDA含量7 d、14 d時(shí)增多，同時(shí)TAOC降低，與同時(shí)點(diǎn)空氣對(duì)照組比較有顯著性差異(p<0.01)，95％氧暴露后3 d、7 d、14 d肺組織MDA含量升高，TAOC降低，與空氣對(duì)照組比較有顯著性差異(p<0.01)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中觀察到空氣對(duì)照組即常氧條件下培養(yǎng)24 h內(nèi)的A

5、ECII呈立方生長(zhǎng)良好，AECII特有結(jié)構(gòu)板層小體較多，48 h后細(xì)胞中可見(jiàn)板層小體排出留下的空泡，72 h細(xì)胞生長(zhǎng)不良，胞漿中空泡增多，板層小體顆粒基本消失，40％氧暴露組AECII體外培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h、72h細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變與空氣對(duì)照組相似，60％氧暴露24 h AECII呈現(xiàn)生長(zhǎng)不良狀態(tài)，48 h胞漿中出現(xiàn)空泡，72 h后細(xì)胞變形，空泡增多，95％氧暴露6 h后即可觀察到AECII細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞連接松散，

6、板層小體顆粒減少，12-24 h后胞漿中空泡明顯增多，細(xì)胞核腫脹，48-72 h細(xì)胞腫脹，喪失正常形態(tài)結(jié)構(gòu)；Annexin V/PI雙標(biāo)記法流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，40％氧暴露后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h早期凋亡細(xì)胞數(shù)及晚期凋亡、壞死細(xì)胞數(shù)與空氣對(duì)照組比較均無(wú)明顯差異，兩組細(xì)胞在干預(yù)后72 h早期凋亡細(xì)胞數(shù)均有所增加，與同組前一時(shí)點(diǎn)比較差別具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，60％氧暴露后24 h發(fā)生早期凋亡及晚期凋亡、壞

7、死的細(xì)胞均增加，48 h、72 h死亡細(xì)胞數(shù)更多，與同時(shí)點(diǎn)空氣對(duì)照組相比差異具有顯著性(p<0.05)，95％氧暴露后6h、12 h、24 h、48 h、72 h隨高氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)生死亡的細(xì)胞越多，較同時(shí)點(diǎn)空氣對(duì)照組具顯著性差異(p<0.05)，死亡細(xì)胞數(shù)較之60％氧暴露組亦明顯增高(p<0.05)；MTT結(jié)果顯示，與同時(shí)點(diǎn)空氣對(duì)照組相比，40％氧暴露6 h、12 h、24 h、48 h、72 h增殖活性無(wú)顯著變化，兩組細(xì)胞增殖均于

8、24 h達(dá)高峰，48 h有所減緩，72 h反而降低，與同時(shí)點(diǎn)空氣對(duì)照組比較，60％氧暴露24 h、48 h、72 h及95％氧暴露后6 h、12 h、24 h，48 h、72 h增殖活性均明顯降低(p<0.01)，細(xì)胞增殖活性隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)降低越為明顯(p<0.05)，與60％氧暴露組比較，95％氧暴露后增殖抑制效應(yīng)更為顯著(p<0.01)；40％氧暴露組及空氣對(duì)照組細(xì)胞ROS含量隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)均無(wú)明顯變化，兩組間同時(shí)點(diǎn)ROS含量亦無(wú)顯

9、著差異，60％氧暴露組ROS水平隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)間逐漸升高，暴露12 h、24 h，48 h、72 h與同時(shí)點(diǎn)空氣對(duì)照組比較有顯著性差異(p<0.01)，95％氧暴露后6 h細(xì)胞ROS含量即增多，且隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)ROS含量的增加越為顯著，各時(shí)點(diǎn)與空氣對(duì)照組比較差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
　　結(jié)論：>60％氧可以時(shí)間依賴及濃度依賴的方式造成肺組織氧化應(yīng)激性損傷，誘導(dǎo)AECII死亡，抑制AECII增殖，導(dǎo)致未成熟肺發(fā)育停滯。

10、
　　第二部分:降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)未成熟鼠肺氧化應(yīng)激性損傷的保護(hù)作用
　　目的:通過(guò)研究高氧暴露后肺組織CGRP含量動(dòng)態(tài)變化和CGRP拮抗劑CGRP8-37干預(yù)后肺組織病理學(xué)、RAC、MDA含量、TAOC的改變，以及CGRP干預(yù)后AECII細(xì)胞增殖、存活的變化，了解CGRP在氧化應(yīng)激性肺損傷中的作用。
　　方法:95％氧暴露制備整體動(dòng)物及原代AECII典型高氧損傷模型，放射免疫法檢測(cè)高氧暴露后肺組織勻漿CGRP含量的動(dòng)

11、態(tài)變化，CGRP受體拮抗劑CGRP8-37干預(yù)后觀察肺組織病理學(xué)改變及RAC，酶標(biāo)儀檢測(cè)MDA含量及組織TAOC水平，外源性CGRP干預(yù)后測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS及TAOC，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)AECII細(xì)胞死亡，MTT法評(píng)估細(xì)胞增殖。
　　結(jié)果:高氧暴露的肺組織CGRP含量隨高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高，于7 d達(dá)到高峰，14 d時(shí)CGRP含量雖較前有所降低但仍明顯高于空氣對(duì)照組水平(p<0.01)，光鏡觀察發(fā)現(xiàn)高氧暴露后早期肺組織炎癥充血，

12、繼而出現(xiàn)肺泡數(shù)目減少，CGRP8-37干預(yù)后肺組織炎癥加重，肺泡結(jié)構(gòu)改建更為顯著，肺組織MDA含量在高氧暴露3d后顯著升高，同時(shí)TAOC明顯減弱，CGRP8-37干預(yù)后3 d、7 d、14 d MDA含量升高及TAOC降低的趨勢(shì)更明顯，與同時(shí)點(diǎn)單純高氧暴露組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)；與空氣對(duì)照組相比，高氧暴露后細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增高(p<0.01)而TAOC顯著降低(p<0.01)，同時(shí)死亡細(xì)胞比例顯著增多(p<0.01)、

13、細(xì)胞增殖活性減弱(p<0.01)，與單純高氧暴露組比較，CGRP干預(yù)后細(xì)胞ROS水平下降、TAOC提升，細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)(p<0.01)，AECII死亡明顯下降(p<0.05)。
　　結(jié)論:氧化應(yīng)激損傷后肺組織CGRP含量增高可能是未成熟肺自我保護(hù)機(jī)制之一。CGRP可減弱氧化應(yīng)激對(duì)AECII增殖的抑制作用，減少細(xì)胞死亡從而改善AECII的存活，這可能是CGRP有利于肺發(fā)育及氧化應(yīng)激性肺損傷修復(fù)的關(guān)鍵。
　　第三部分:降鈣素基

14、因相關(guān)肽氧化應(yīng)激肺損傷保護(hù)作用的Wnt7b/β-catenin信號(hào)機(jī)制
　　目的:研究高氧暴露后早產(chǎn)鼠肺Wnt7b、β-catenin蛋白水平變化及高氧、CGRP干預(yù)后Wnt通路下游基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TCF、靶基因c-myc mRNA表達(dá)，了解Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否參與了氧化應(yīng)激導(dǎo)致的AECII損傷死亡和肺發(fā)育障礙及其與CGRP肺保護(hù)作用的關(guān)系。
　　方法: western blot檢測(cè)95％高氧暴露早產(chǎn)鼠肺組織及高氧、CGR

15、P干預(yù)后原代AECII Wnt7b、β-catenin蛋白水平，RT-PCR測(cè)定TCF及c-myc mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:高氧暴露后3 d肺組織Wnt7b及β-catenin蛋白表達(dá)即較空氣對(duì)照組顯著增強(qiáng)(p<0.05)，7 d時(shí)蛋白水平達(dá)到峰值，14 d時(shí)表達(dá)有所下降，但仍明顯高于空氣對(duì)照組水平(p<0.05)；與空氣對(duì)照組比較，高氧組AECII TCF及c-myc mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(p<0.01)，高氧+CGRP組較之