XTP4對HepG2細(xì)胞凋亡和增殖的影響及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　通過對乙型肝炎病毒X蛋白（Hepatitis B virus X protein，HBXAg）反式激活基因4（HBX protein trans-activate gene4，XTP4）對HepG2細(xì)胞凋亡和增殖的影響及相關(guān)機(jī)制的研究，探討其在HBV相關(guān)肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　方法：
　　構(gòu)建XTP4基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His（-）A-XTP4(pXTP4)及化學(xué)合成XTP4基

2、因的小干擾RNA（Small interference RNA）（siXTP4）后，分別將XTP4基因的真核表達(dá)質(zhì)粒、小干擾RNA及各自的陰性對照（NC、siNC）瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞中，48h后進(jìn)行以下實驗。應(yīng)用Western blot檢測驗證XTP4蛋白的過表達(dá)和干擾表達(dá)是否成功；利用Annexin V/7AAD流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況；采用Western blot檢測各組p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表

3、達(dá)水平，比較各組間 p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)差異，并計算Bcl-2/Bax比值；應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法檢測各組胱冬肽酶-3（Caspase-3）的活性變化；采用細(xì)胞增殖活性檢測試劑CCK8檢測各組細(xì)胞增殖活性改變。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建了XTP4的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His（-）A-XTP4（pXTP4），雙酶切及測序鑒定構(gòu)建的真核表達(dá)載體，均正確無誤；
　　2、West

4、ern blot驗證了蛋白水平XTP4的成功過表達(dá)和干擾表達(dá)；
　　3、和各自的對照組相比，XTP4過表達(dá)的HepG2細(xì)胞中，Annexin V＋細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05），干擾XTP4表達(dá)的HepG2細(xì)胞中，Annexin V＋細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05）；
　　4、和各自的對照組相比，XTP4過表達(dá)的HepG2細(xì)胞中，Bcl-2/Bax比值增高（P＜0.05），p53蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；干擾XTP4表達(dá)的

5、HepG2細(xì)胞中，Bcl-2/Bax比值降低（P＜0.05），p53蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；
　　5、與各自的對照組相比，過表達(dá)XTP4的 HepG2細(xì)胞中，胱冬肽酶-3活性下降（P＜0.05），Caspase-3蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；干擾XTP4表達(dá)的HepG2細(xì)胞中，胱冬肽酶-3活性上升（P＜0.05）， Caspase-3蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；6、和各自的對照組相比，XTP4過表達(dá)的HepG2細(xì)胞中，細(xì)