HSP70在機體創(chuàng)傷應(yīng)激及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定作用的實驗研究.pdf

1、第一章BRL大鼠肝細胞HSP70的表達及意義
　　 目的：通過熱休克預(yù)處理提高BRL大鼠肝臟細胞HSP70的表達水平，建立體外實驗研究的熱休克模型。
　　 方法：選擇生長良好的且未鋪滿培養(yǎng)瓶底的BRL大鼠肝細胞做熱休克反應(yīng)。BRL大鼠肝臟細胞40～42℃熱處理30'后分別培養(yǎng)2h、8h、12h、24h、48h，用Western-blot檢測HSP70蛋白表達情況。正常BRL大鼠肝細胞用不同濃度的谷氨酰胺、槲皮素分別進行培

2、養(yǎng)2h后，42℃熱浴30'，于培養(yǎng)2h、8h、12h、24h、48h后測細胞成活率及用Western-blot檢測HSP70蛋白、GR蛋白表達情況。
　　 結(jié)果：40～42℃熱處理BRL大鼠肝細胞30'后，37℃培養(yǎng)48h細胞的成活率大于95％。正常BRL大鼠肝細胞HSP70含量較低，熱處理后2hHSP70表達迅速增加，8h明顯升高，12h達到頂峰，24小時仍處在較高水平，48h稍高于正常。40℃、41℃、42℃熱處理后BRL大

3、鼠肝細胞HSP70的表達在各時相點均高于正常對照組，發(fā)現(xiàn)在42℃2h、8h、12h、24hHSP70的表達明顯高于40℃、41℃，48小時稍高于40℃、41℃。41℃各時相點HSP70表達均高于40℃，但無顯著性差異。因此選用42℃熱處理30'做為BRL大鼠肝細胞的熱休克反應(yīng)溫度及時間。
　　 結(jié)論：(1)正常BRL大鼠肝細胞HSP70表達較低，42℃熱處理30'方法可以成功誘導(dǎo)BRL大鼠肝細胞高表達HSP70，此方法不會導(dǎo)致連

4、續(xù)培養(yǎng)48h后細胞成活數(shù)量的明顯變化，成功建立了BRL大鼠肝細胞熱休克模型。(2)谷氨酰胺可以誘導(dǎo)HSP70的高表達，對細胞有保護作用，槲皮素可以明顯抑制HSP70的表達，導(dǎo)致細胞成活數(shù)量的明顯降低。8mmol/L谷氨酰胺、150umol/L槲皮素分別為誘導(dǎo)、抑制HSP70表達的最佳濃度，并為動物實驗提供劑量參考。(3)熱休克反應(yīng)及谷氨酰胺可以誘導(dǎo)BRL大鼠肝細胞HSP70高表達，GR呈低表達。槲皮素干預(yù)后，GR也呈低表達，但較谷氨酰胺

5、干預(yù)組有所升高。
　　 第二章不同切肝量大鼠HSP70的表達及意義
　　 目的：檢測大鼠不同程度手術(shù)創(chuàng)傷后血清及肝臟組織中HSP70的表達，研究HSP70與手術(shù)創(chuàng)傷程度、創(chuàng)傷致內(nèi)環(huán)境及肝功能改變、GC、GR之間的關(guān)系，探討HSP70評價手術(shù)創(chuàng)傷程度及對內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、肝臟的保護作用及機制。
　　 方法：1.動物模型建立：雄性健康Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機分為(1)正常對照組：大鼠不作任何手術(shù)處理。(

6、2)手術(shù)創(chuàng)傷組：①輕度創(chuàng)傷組：大鼠肝臟左外葉切除組；②中度創(chuàng)傷組：大鼠肝臟左外葉和右葉切除組；③重度創(chuàng)傷組：大鼠肝臟左外葉、右葉、乳頭葉和尾狀葉切除組。(3)谷氨酰胺干預(yù)組：在手術(shù)前2h尾靜脈推注0.75g/kg谷氨酰胺，分為谷氨酰胺干預(yù)輕度創(chuàng)傷組、谷氨酰胺干預(yù)中度創(chuàng)傷組、谷氨酰胺干預(yù)重度創(chuàng)傷組。(4)槲皮素干預(yù)組：在手術(shù)前2h腹腔注入7mg/kg，分為槲皮素干預(yù)輕度創(chuàng)傷組、槲皮素干預(yù)中度創(chuàng)傷組、槲皮素干預(yù)重度創(chuàng)傷組。(5)米非司酮干預(yù)

7、組：在手術(shù)前2h肌肉注射5mg/kg米非司酮，分為米非司酮干預(yù)輕度創(chuàng)傷組、米非司酮干預(yù)中度創(chuàng)傷組、米非司酮干預(yù)重度創(chuàng)傷組。
　　 結(jié)果：(1)模型的成功建立：采用對SD大鼠行肝葉切除術(shù)成功建立不同程度手術(shù)創(chuàng)傷的模型，手術(shù)輕度創(chuàng)傷組、中度創(chuàng)傷組、重度創(chuàng)傷組大鼠存活率分別為98.0％、94.0％、92.0％，組間比較無顯著性差異，為研究不同程度手術(shù)創(chuàng)傷對機體的影響建立了動物模型。
　　 (2)血清HSP70的表達。
　

8、　 (3)肝功能的變化。
　　 (4)手術(shù)創(chuàng)傷組術(shù)后內(nèi)環(huán)境的變化㈠K+的變化。
　　 (5)肝臟組織HSP70和HSP70mRNA的表達。
　　 (6)肝臟組織GR和GRmRNA的表達：
　　 ①手術(shù)創(chuàng)傷組：肝臟組織GR和GRmRNA的表達有一致性。正常大鼠肝臟GR和GRmRNA有一定含量，術(shù)后表達開始下降，8h明顯降低，12h達到最低，24h有所恢復(fù)仍較低，48h接近正常。在每一時相點GR和GRmRN

9、A的表達均低于正常，隨著手術(shù)創(chuàng)傷程度的增加肝臟組織中GR和GRmRNA表達水平逐漸下降；術(shù)后8、12、24h時相點輕度、中度、重度之間比較有顯著差異性(P＜0.05)。②谷氨酰胺干預(yù)組：在各時相點GR和GRmRNA表達均較正常有所下降，隨著手術(shù)創(chuàng)傷程度的增加肝臟組織中GR和GRmRNA表達水平逐漸下降；術(shù)后8、12h時相點輕度、中度、重度之間比較有顯著性差異(P＜0.05)。與手術(shù)創(chuàng)傷組比較在術(shù)后8h、12h有顯著性差異(P＜0.05)

10、。③槲皮素干預(yù)組：在各時相點GR和GRmRNA表達均較正常組下降，較手術(shù)創(chuàng)傷組有輕度升高，但無統(tǒng)計學意義。槲皮素干預(yù)組較谷氨酰胺干預(yù)組在術(shù)后8h、12h、24h有所升高(P＜0.05)。手術(shù)創(chuàng)傷大鼠肝臟GRmRNA的表達和GR的表達有一致性。
　　 結(jié)論：(1)在不同程度手術(shù)創(chuàng)傷后，血清HSP70和皮質(zhì)醇隨創(chuàng)傷程度增加而升高，兩者有正相關(guān)性，血清HSP70可作為判斷手術(shù)創(chuàng)傷程度的指標。(2)手術(shù)創(chuàng)傷后大鼠內(nèi)環(huán)境指標Na+、K+、

11、PH值隨著HSP70升高逐漸趨于至正常水平；術(shù)前谷氨酰胺誘導(dǎo)HSP70的高表達可使手術(shù)創(chuàng)傷后內(nèi)環(huán)境指標和肝功能明顯改善；HSP70對內(nèi)環(huán)境及肝功能有保護作用。(3)血清HSP70、肝臟HSP70及HSP70mRNA的表達在創(chuàng)傷程度及時程上有一定的一致性，手術(shù)創(chuàng)傷后HSP70在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平同時增強。(4)在手術(shù)創(chuàng)傷中，隨著HSP70的高表達，GR表達下降，兩者具有一定的負相關(guān)性；誘導(dǎo)HSP70高表達后，GR仍有所下降，肝功能及穩(wěn)態(tài)指標趨

12、于正?；蚝棉D(zhuǎn)；阻斷GR后，HSP70更為升高，但肝功能及穩(wěn)態(tài)指標趨于惡化，在手術(shù)創(chuàng)傷中HSP70可能參與并啟動了抗損傷，在一定程度上反映了肝臟損傷的程度。(5)HSP70與GC、GR均參與手術(shù)應(yīng)激，HSP70影響GR的釋放與代謝，GC與GR亦有負相關(guān)性；在手術(shù)創(chuàng)傷中HSP70與GR之間如何調(diào)控有待進一步研究。
　　 第三章臨床肝癌病人手術(shù)后HSP70的變化及意義
　　 目的：探討肝臟切除患者血清HSP70在評價手術(shù)創(chuàng)傷程

13、度中的意義。
　　 方法：用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測肝癌患者肝臟切除術(shù)前、術(shù)后2、12、24、48、72h血清HSP70表達并同時檢測血清皮質(zhì)醇的濃度及檢測2、24、48、72、120h肝功能的變化，并進行比較。肝臟切除患者分為開腹左外葉切除、開腹左半肝切除組、開腹左三葉切除組、腹腔鏡左外葉切除組。
　　 結(jié)果：肝臟切除術(shù)后2h血清HSP70明顯升高，12h維持在高水平，24h達到高峰，48h仍高于正常水平，7

14、2h略高于正常；在術(shù)后2、12、24、48h隨著切除肝量的增加HSP70的表達增加(p＜0.05)；開腹肝臟左外葉切除、左半肝切除組、左三葉切除組三組之間比較在術(shù)后2、12、24、48h時相點HSP70的表達有顯著性差異(p＜0.05)。血清皮質(zhì)醇于術(shù)后2h迅速增加，12h達到高峰，24小時仍有較高濃度，48h高于正常，72小時恢復(fù)正常；在術(shù)后12h、24h隨著切除肝量的增加皮質(zhì)醇的濃度明顯增加；開腹肝臟左外葉切除組、左半肝切除組、左三

15、葉切除組三組之間在術(shù)后12、24h時相點皮質(zhì)醇濃度有顯著性差異(p＜0.05)。腹腔鏡左外葉切除組HSP70表達在術(shù)后12、24h低于開腹左外葉切除組(P＜0.05)，腹腔鏡左外葉切除組在術(shù)后12h皮質(zhì)醇濃度低于開腹左外葉切除組(P＜0.05)。術(shù)后2hALT、TB開始升高，24h達到峰值，72h明顯高于正常，120h接近正常；術(shù)后2、24、48、72h ALT、TB均明顯高于術(shù)前(P＜0.05)。開腹左外葉切除組、開腹左半肝切除組、開

16、腹左三葉切除組三組之間比較在術(shù)后24、48、72h ALT、TB濃度有顯著性差異(P＜0.05)。腹腔鏡左外葉切除組與開腹左半肝切除組、開腹左三葉切除組之間比較在術(shù)后24、48、72hALT、TB濃度有顯著性差異(P＜0.05)?？偟鞍住椎鞍仔g(shù)后2h開始下降，分別于術(shù)后24h、72h降至最低，術(shù)后120h未恢復(fù)到術(shù)前水平，術(shù)后與術(shù)前比較有顯著性差異(P＜0.05)；總蛋白在術(shù)后24、48、72h開腹左外葉切除組、腹腔鏡左外葉切除組分別

17、與開腹左半肝切除組、開腹左三葉切除組之間比較有顯著性差異(P＜0.05)。白蛋白在術(shù)后72h開腹左三葉切除組與開腹左外葉切除組、開腹左半肝切除組、腹腔鏡左外葉切除組之間比較有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：1.手術(shù)創(chuàng)傷可以引起血清HSP70和皮質(zhì)醇濃度的明顯升高，兩者具有一定的正相關(guān)性，且隨著手術(shù)創(chuàng)傷程度的增加而顯著升高；HSP70的表達與肝功能的變化在手術(shù)創(chuàng)傷程度及時程上有一致性。2.血清中檢測HSP70的表達可以作