p55PIK-慢性炎癥分子干預的新靶點.pdf

1、第一部分：
　　 目的:
　　 1．觀察磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的調(diào)節(jié)亞單位—p55PIK氨基端24個氨基酸(N24)對人角質(zhì)形成細胞株—HaCaT細胞增殖的影響。
　　 2．觀察不同濃度以及不同時間脂多糖刺激下HaCaT細胞釋放炎性因子TNF-α的變化。
　　 3．觀察磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的調(diào)節(jié)亞單位p55PIK及其氨基端24個氨基酸對脂多糖刺激HaCaT細胞釋放細胞因子TNF-α、

2、IL-6和IL-8的影響,為臨床治療工作提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 利用分子生物學手段構(gòu)建并表達純化了含有PI3K-p55PIK-N末端24個氨基酸的TAT-N24融合多肽、腺病毒AD-N24-GFP和含有PI3K-p55PIK的腺病毒AD-p55PIK-GFP,能夠高效的攜帶N24或p55PIK進入細胞內(nèi)。以人角質(zhì)形成細胞株—HaCaT細胞為研究對象，以脂多糖(lipopolysaccharides LPS)刺

3、激為主要誘導方式，探索N24對HaCaT細胞增殖的影響，應(yīng)用CFDA標記法檢測細胞增殖情況；探索LPS的最佳刺激時間和刺激濃度，采用ELISA法、ReAltime-PCR法檢測N24及p55PIK干預下TNF-α、IL-6和IL-8蛋白水平及mRNA水平的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1．成功構(gòu)建并表達純化了TAT-N24融合多肽和腺病毒AD-N24-GFP,AD-p55PIK-GFP；TAT-N24能有效阻滯HaCaT細

4、胞周期進程于G0/G1期,S期和G2/M期細胞減少, TAT-N24組各期細胞分布為:G0/G1期(80.37±1.09)％,S期(7.81±1.97)％,G2/M期(11.82±1.71)％,而對照多肽組各期細胞分布為：G0/G1期(58.54±2.06)％, S期(26.34±1.69)％, G2/M期(15.12±1.91)％,空白對照組各期細胞分布為：G0/G1期(60.14±2.06)％, S期(25.32±1.78)％, G

5、2/M期(14.34±1.39)％，組間有顯著性差異（p<0.05）; BrdU陽性細胞比例顯示：TAT-N24組R2為：(8.37±2.06)％,對照多肽組R2為：(28.14±4.69)％, 空白對照組R2為：(26.73±3.58)％,提示TAT-N24能有效抑制HaCaT細胞的DNA合成; CFDA檢測顯示TAT-N24組增殖指數(shù)(PI)為：30.75±3.66,對照多肽組增殖指數(shù)(PI)為：47.81±5.66,空白對照組增殖

6、指數(shù)(PI)為：50.16±5.33,有顯著差異（p<0.05）提示TAT-N24能有效抑制HaCaT細胞的增殖。
　　 2．成功構(gòu)建LPS刺激下HaCaT細胞釋放炎性因子的模型。正常狀態(tài)下的HaCaT細胞有TNF-α、IL-6和IL-8的自發(fā)性分泌；LPS刺激后的HaCaT細胞TNF-α、IL-6和IL-8的分泌量明顯增加這與銀屑病患者皮損中細胞因子的變化非常相似。ELISA法確認LPS最佳的刺激濃度和刺激時間，使HaCaT細

7、胞釋放炎性因子TNF-α水平達到最高。
　　 3．TAT-N24作用于HaCaT細胞后其TNF-α的分泌量有一定的增加,它們可能參與了對正常皮膚的炎性刺激作用,一定濃度TAT-N24可有效抑制LPS刺激HaCaT細胞釋放TNF-α、IL-6和IL-8。ELISA檢測結(jié)果顯示：相對于LPS刺激組，TAT-N24干預組的細胞上清內(nèi)TNF-α、IL-6和IL-8的濃度分別由208.06±30.18pg/ml、86.4±9.78pg/m

8、l和260.59±54.05pg/ml下降至121.78±22.26pg/ml、53.18±7.36pg/ml和125.08±35.17 pg/ml。ReAltime-PCR結(jié)果顯示：正常HaCaT細胞可以分泌一定程度的炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8。內(nèi)毒素（LPS）刺激HaCaT細胞后，炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8的釋放增加，加入TAT-N24干預后，上述三種促炎因子的表達降低。而AD-N24-GFP也可以抑制LPS

9、刺激HaCaT細胞釋放炎性因子（TNF-α、IL-6和IL-8）的表達，其作用和TAT-N24功能類似; AD-p55PIK-GFP自身也可以導致炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8的釋放增加，加入LPS刺激后，炎性因子的釋放增加，與空白對照組及無AD-p55PIK-GFP干預下LPS刺激組比較，其差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 4．ReAltime-PCR法檢測結(jié)果顯示：正常HaCaT細胞有一定程度的TNF-α、IL-6和IL-

10、8mRNA的表達， LPS刺激后，上述三種炎性因子有不同程度的升高。 HaCaT細胞經(jīng)TAT-N24和AD-N24-GFP預先處理過后，LPS刺激下炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8相對于未預先處理組mRNA水平表達降低；感染AD-p55PIK-GFP后，HaCaT細胞在LPS刺激下炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8mRNA水平表達升高。
　　 第二部分:
　　 目的：探討N24及p55PIK在HaCaT細胞內(nèi)對

11、TLR2、TLR4及其信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控機制。
　　 方法：免疫組化檢測NF-κB P65在HaCaT細胞內(nèi)的表達情況；免疫熒光激光共聚焦顯微鏡分析NF-κB P65在HaCaT細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)位表達情況；Western Bloting檢測分析AD-N24-GFP及AD-p55PIK-GFP干預后，LPS刺激下HaCaT細胞內(nèi)TLRs信號通路蛋白的表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、免疫細胞化學結(jié)果提示正常HaCaT細

12、胞內(nèi)NF-ＫB P65蛋白主要表達在細胞漿內(nèi)，低染，LPS刺激后P65蛋白轉(zhuǎn)位入核，在核內(nèi)表達增加，高染; 感染AD-N24-GFP后NF-κB P65在細胞核內(nèi)的表達降低。
　　 2、免疫熒光后激光共聚焦顯微鏡分析結(jié)果顯示正常HaCaT細胞內(nèi)NF-κB P65蛋白主要表達在細胞漿內(nèi)，LPS刺激后NF-κB P65轉(zhuǎn)位入核，在核內(nèi)表達增加;感染AD-N24-GFP后NF-κB P65蛋白在核內(nèi)的表達降低。
　　 3、We

13、stern Bloting結(jié)果提示 LPS刺激下HaCaT細胞內(nèi)TLRS通路中各蛋白均有不同程度的改變，TLR2、TLR4表達增加，它們在4小時內(nèi)達到高峰，隨后逐漸降低，但到24小時仍然高于正常細胞表達水平；感染AD-N24-GFP后，其表達情況未見明顯變化，感染AD-p55PIK-GFP后TLR2及TLR4表達均增加；MyD88蛋白表達隨LPS刺激時間的增加而增加，到8小時達到最高點，然后逐漸下降但24小時內(nèi)仍高于正常水平，感染AD-

14、N24-GFP后MyD88表達降低，而感染AD-p55PIK-GFP其表達增加；磷酸化Akt(p-Akt)表達隨LPS刺激時間增加而增加，在2小時達到最高峰，以后逐漸降低，到24小時已經(jīng)基本恢復到正常水平，感染AD-N24-GFP后其表達情況為未見明顯改變；感染AD-p55PIK-GFP后p-Akt表達增加；ERKs從30分鐘起磷酸化激活增強(P<0.05),4小時達高峰(P<0.05),其后逐漸下降,但直至24小時仍顯著高于基礎(chǔ)水平(

15、P<0.05)。JNK/SAPK、p38亦有與ERKs磷酸化激活相同的變化趨勢,所不同的是,JNK/SAPK磷酸化在4h高峰值以后迅速下降(P<0.05), 至24小時已經(jīng)回復到基礎(chǔ)水平。P38磷酸化在4h高峰后迅速下降(P<0.05),但24小時仍略高于基礎(chǔ)水平(圖2)。感染AD-N24-GFP及AD-p55PIK-GFP后其表達情況為未見明顯改變；IκB-α于LPS刺激后30分鐘出現(xiàn)表達降低，到4小時達到最低點，到16小時開始逐步恢