豬吲哚2,3-二氧化酶介導人血清對豬血管內皮細胞殺傷作用的研究.pdf

1、第一部分:[目的]證明豬IDO基因的存在，分析并克隆豬IDO基因的編碼序列，明確其生物信息學結構特點及表達分布特點。
　　 [方法]運用生物信息學方法從GenBank獲得與人IDO基因同源的豬EST序列，通過電子克隆得到預測序列，再經比對得相似度高的豬mRNA序列，然后通過RT-PCR技術在豬血管內皮細胞系PED中驗證該序列的準確性，對該序列進行生物信息學分析，并在核酸水平研究其組織表達分布特點。應用體細胞雜交板（somatic

2、 cell hybrid panel，SCHP）技術對豬IDO基因進行染色體定位分析。以已公布的人IDO同源蛋白的三級結構為模板，利用生物信息學軟件及相關數據庫構建豬IDO蛋白的三維空間結構模型。
　　 [結果]通過分子克隆、測序、同源性分析，證實豬存在IDO基因，將結果提交至GenBank，獲得登錄號為HM209418。豬IDO基因在豬的胸腺、肺、附睪和眼底中有基礎水平的表達，尤其在豬外周血單核/巨噬細胞中表達豐富，IFN-γ

3、刺激后豬血管內皮細胞上可表達IDO。
　　 [結論]生物信息學方法指導分子生物學實驗，有助于新基因的預測、發(fā)現(xiàn)與鑒定。本研究確證了豬存在IDO基因的推測，明確了該基因相關的分子結構信息，為研究豬IDO蛋白的免疫學功能奠定了基礎。
　　 第二部分:[目的]分別構建高水平表達天然poIDO分子和帶標簽蛋白的poIDO融合蛋白的重組表達載體。
　　 [方法]利用RT-PCR擴增豬IDO基因編碼區(qū)片段，連接至T載體，經測

4、序驗證無誤后，分別亞克隆至真核表達載體pcDNA 3.1(-)和pCMV-Tag2B，構建重組質粒。將重組質粒和空載體分別轉染至CHO細胞和PED細胞，用G418進行篩選；通過Western Blot、免疫化學和免疫熒光等方法檢測，鑒定出能穩(wěn)定表達pcDNA 3.1(-)-poIDO、 pcDNA 3.1(-)的PED細胞亞群和能穩(wěn)定表達pCMV-Tag2B-poIDO和pCMV-Tag2B的CHO細胞亞群。
　　 [結果]經過

5、雙酶切和測序鑒定，重組質粒pcDNA 3.1(-)-poIDO與pCMV-Tag2B-poIDO構建成功。
　　 [結論]成功構建出能表達天然豬IDO分子的載體質粒pcDNA 3.1(-)-poIDO和能表達出融合蛋白pCMV-Tag2B-poIDO，該蛋白可作為豬IDO介導人血清殺傷豬血管內皮細胞作用研究的重要工具。
　　 第三部分：[目的]研究豬IDO在人血清對豬內皮細胞殺傷效果中的作用，并進一步研究其在這一過程中的

6、作用機制。
　　 [方法]利用流式細胞術檢測IDO特異性阻斷劑1-MT對人血清對PED殺傷效果的影響，由此初步判斷IDO對人血清殺傷豬血管內皮細胞的影響。建立用PI單染法檢測人血清對豬血管內皮細胞系（SV-40-PED）細胞毒作用的方法。
　　 [結果]人血清對豬血管內皮細胞的殺傷作用顯著；在加入1-MT后，人血清對豬血管內皮細胞的殺傷效果受到抑制。
　　 [結論] IDO促進人血清對豬血管內皮細胞的殺傷作用；P