豬吲哚2,3-二氧化酶介導(dǎo)人血清對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞殺傷作用的研究.pdf

1、第一部分:[目的]證明豬IDO基因的存在，分析并克隆豬IDO基因的編碼序列，明確其生物信息學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及表達(dá)分布特點(diǎn)。
　　 [方法]運(yùn)用生物信息學(xué)方法從GenBank獲得與人IDO基因同源的豬EST序列，通過電子克隆得到預(yù)測序列，再經(jīng)比對得相似度高的豬mRNA序列，然后通過RT-PCR技術(shù)在豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系PED中驗(yàn)證該序列的準(zhǔn)確性，對該序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并在核酸水平研究其組織表達(dá)分布特點(diǎn)。應(yīng)用體細(xì)胞雜交板（somatic

2、 cell hybrid panel，SCHP）技術(shù)對豬IDO基因進(jìn)行染色體定位分析。以已公布的人IDO同源蛋白的三級結(jié)構(gòu)為模板，利用生物信息學(xué)軟件及相關(guān)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建豬IDO蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)模型。
　　 [結(jié)果]通過分子克隆、測序、同源性分析，證實(shí)豬存在IDO基因，將結(jié)果提交至GenBank，獲得登錄號為HM209418。豬IDO基因在豬的胸腺、肺、附睪和眼底中有基礎(chǔ)水平的表達(dá)，尤其在豬外周血單核/巨噬細(xì)胞中表達(dá)豐富，IFN-γ

3、刺激后豬血管內(nèi)皮細(xì)胞上可表達(dá)IDO。
　　 [結(jié)論]生物信息學(xué)方法指導(dǎo)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，有助于新基因的預(yù)測、發(fā)現(xiàn)與鑒定。本研究確證了豬存在IDO基因的推測，明確了該基因相關(guān)的分子結(jié)構(gòu)信息，為研究豬IDO蛋白的免疫學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分:[目的]分別構(gòu)建高水平表達(dá)天然poIDO分子和帶標(biāo)簽蛋白的poIDO融合蛋白的重組表達(dá)載體。
　　 [方法]利用RT-PCR擴(kuò)增豬IDO基因編碼區(qū)片段，連接至T載體，經(jīng)測

4、序驗(yàn)證無誤后，分別亞克隆至真核表達(dá)載體pcDNA 3.1(-)和pCMV-Tag2B，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞和PED細(xì)胞，用G418進(jìn)行篩選；通過Western Blot、免疫化學(xué)和免疫熒光等方法檢測，鑒定出能穩(wěn)定表達(dá)pcDNA 3.1(-)-poIDO、 pcDNA 3.1(-)的PED細(xì)胞亞群和能穩(wěn)定表達(dá)pCMV-Tag2B-poIDO和pCMV-Tag2B的CHO細(xì)胞亞群。
　　 [結(jié)果]經(jīng)過

5、雙酶切和測序鑒定，重組質(zhì)粒pcDNA 3.1(-)-poIDO與pCMV-Tag2B-poIDO構(gòu)建成功。
　　 [結(jié)論]成功構(gòu)建出能表達(dá)天然豬IDO分子的載體質(zhì)粒pcDNA 3.1(-)-poIDO和能表達(dá)出融合蛋白pCMV-Tag2B-poIDO，該蛋白可作為豬IDO介導(dǎo)人血清殺傷豬血管內(nèi)皮細(xì)胞作用研究的重要工具。
　　 第三部分：[目的]研究豬IDO在人血清對豬內(nèi)皮細(xì)胞殺傷效果中的作用，并進(jìn)一步研究其在這一過程中的

6、作用機(jī)制。
　　 [方法]利用流式細(xì)胞術(shù)檢測IDO特異性阻斷劑1-MT對人血清對PED殺傷效果的影響，由此初步判斷IDO對人血清殺傷豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。建立用PI單染法檢測人血清對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系（SV-40-PED）細(xì)胞毒作用的方法。
　　 [結(jié)果]人血清對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷作用顯著；在加入1-MT后，人血清對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷效果受到抑制。
　　 [結(jié)論] IDO促進(jìn)人血清對豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷作用；P