高糖通過環(huán)氧化酶2依賴性途徑誘導血管內皮細胞內質網應激.pdf

1、背景： 心血管并發(fā)癥被認為是糖尿病患者的主要死亡原因之一。大量的臨床和實驗室研究證實，血糖增高引起的血管內皮代謝紊亂和形態(tài)異常是糖尿病血管損傷的關鍵。實驗證實了高糖可以誘發(fā)血管內皮細胞發(fā)生凋亡，但是其作用機制尚不明確。內質網(endoplasmic reticulum，ER)途徑是近年來發(fā)現的一條細胞內凋亡途徑。內質網穩(wěn)態(tài)的破壞能夠影響蛋白質的折疊，從而引起非折疊蛋白應答(unfolded protein response，UP

2、R)或稱為內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)?；瘜W毒素，氧化應激與／或內質網中錯誤折疊蛋白的積累都會破壞內質網功能，導致內質網應激的發(fā)生。高糖誘導的線粒體活性氧釋放增加是導致糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的主要因素。所以，我們推測內質網應激途徑亦可能參與了高糖誘導的血管內皮細胞的凋亡過程。 近年來，血糖增高誘發(fā)的炎癥被認為是糖尿病心血管病變的另一主要機制。有證據均提示，內皮源性的

3、COX-2可能是糖尿病介導血管炎性反應的重要遞質，但COX-2是否亦參與了高糖誘導的血管內皮細胞的內質網應激途徑還有待于進一步證明。 目的： 本實驗將主要觀察高糖對血管內皮細胞內質網應激途徑中標志蛋白葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)和C／EBP同源蛋白(C／EBP homologous protein，CHOP)的影響，并闡明COX-2在其中的作用。 方法

4、： (1)人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)分別用含5.5mmol／L與30mmol／L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基進行處理24、36和48 h。(2)細胞活性用MTT法米測定。(3)細胞凋亡用PI染色流式細胞術來確定。(4)COX-2，GRP78和CHOP的表達情況用Western Blotting來確定。 結果： 高糖對HUVECs細胞存活

5、率的影響分別用含正常糖(5.5mmol／L)和高糖(30mmol／L)的DMEM培養(yǎng)基孵育HUVECs細胞24，36或48 h后，用M訂法檢測細胞存活率。結果顯示，高糖孵育24 h對細胞存活率無明顯影響。然而，高糖孵育36～48 h后，高糖組的OD值明顯低于相應對照組(P＜0.01)與相應對照組相比，甘露醇處理對細胞存活率無明顯影響。 高糖對HUVECs細胞GRP78和CHOP蛋白表達的影響Western Blotting結果顯

6、示，與相同孵育時間的正常糖對照組相比，HUVECs細胞經高糖孵育24～36 h后，GRP78蛋白表達量增高(P＜0.01)；但細胞經高糖孵育48 h后，GRP78蛋白表達量反而減少(P＜0.05)。HUVECs細胞經高糖孵育24h后，對CHOP蛋白的表達量無明顯影響，但對細胞經高糖孵育36～48 h后，CHOP蛋白的表達量明顯增加(P＜0.01)。甘露醇對GRP78和CHOP蛋白表達量均無明顯影響。 高糖對HUVECs細胞COX

7、-2蛋白表達的影響Western Blotting結果顯示，與相同孵育時間的正常糖對照組相比，HUVECs細胞經高糖孵育24-48 h后，COX-2蛋白表達量逐漸增高(P＜0.01)，并呈現時間依從性。甘露醇對HUVECs細胞COX-2蛋白表達量無明顯影響。 COX-2抑制劑尼美舒利對GRP-78和CHOP蛋白表達的影響Western Blotting結果顯示，與正常糖組對照相比，HUVECs細胞經高糖孵育48 h后，GRP78

8、蛋白表達減少而CHOP蛋白表達增加：然而，經尼美舒利與高糖共孵育后，可明顯抑制高糖引起的GRP78蛋白表達減少，以及CHOP蛋白表達增加P＜0.05)。單純尼美舒利對HUVECs細胞GRP78和CHOP蛋白表達均明顯影響。 尼美舒利對高糖誘導的細胞生存率下降和細胞凋亡的影響與正常糖對照組相比，用含高糖的DMEM培養(yǎng)基孵育HUVECs細胞48 h后，細胞生存率下降，細胞凋亡增加。尼美舒利對高糖誘導的細胞生存率下降和細胞凋亡有顯著抑