慢性乙型肝炎患者外周血樹(shù)突狀細(xì)胞Toll樣受體3觸發(fā)后I型干擾素表達(dá)的研究.pdf

1、慢性乙型病毒性肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)的發(fā)病機(jī)制一直是傳染病領(lǐng)域研究的重點(diǎn)、難點(diǎn)。至今,乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染慢性化及其持續(xù)感染的機(jī)制尚未闡明。在當(dāng)前慢性乙型肝炎治療缺乏有效措施的情形下,研究闡釋HBV感染慢性化及持續(xù)感染的發(fā)生機(jī)制尤顯重要、緊迫。
　　 很多患者在HBV急性感染后不能徹底清除病毒而導(dǎo)致HBV感染的持續(xù),最終成為CHB患者。目前,CHB是全球性

2、的公共衛(wèi)生問(wèn)題,全世界范圍內(nèi)有3.5億HBV攜帶者,相當(dāng)大的一部分患者發(fā)展為嚴(yán)重的并發(fā)癥,如肝硬化、肝細(xì)胞肝癌等。雖然對(duì)于一個(gè)患者為何發(fā)展成為慢性攜帶、HBV持續(xù)感染狀態(tài)的確切機(jī)制還不明了,但是可以肯定的是,宿主免疫反應(yīng)的缺陷在這一病理過(guò)程的形成中起了至關(guān)重要的作用[1]。機(jī)體的抗病毒感染免疫包括天然免疫和適應(yīng)性免疫兩大部分,而作為重要天然免疫細(xì)胞的樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic Cells,DCs),是目前所知功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(

3、Antigen:Presenting Cells,APCs),廣泛分布于淋巴組織和非淋巴組織,捕獲、提呈抗原(Antigen,Ag)給T淋巴細(xì)胞,啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答,因而在連接天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起了重要的橋梁作用。
　　 較普遍的觀點(diǎn)是在HBV持續(xù)感染中存在DCs的功能障礙、成熟障礙,不能激活初始T淋巴細(xì)胞(Na(I)ve T Lymphocyte),進(jìn)而不能啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答(尤其是針對(duì)HBV的特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答),

4、而不能清除肝細(xì)胞中的HBV,最終導(dǎo)致了HBV的持續(xù)感染,故而認(rèn)為DCs功能障礙、成熟障礙在HBV持續(xù)感染時(shí)起了關(guān)鍵性的作用。但目前對(duì)DCs功能障礙、成熟障礙的確切機(jī)制不甚明了。而DCs的成熟有賴于病原體源性信號(hào)、T細(xì)胞源性信號(hào)和炎性環(huán)境三者的共同作用。而干擾素(Interferon,IFN)作為炎性環(huán)境中很重要的因素,在DCs的成熟誘導(dǎo)過(guò)程中至關(guān)重要[2]。如同DCs功能的發(fā)揮有賴于Toll樣受體(Toll-like Receptors

5、,TLRs)的激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)一樣[3],作為誘導(dǎo)DCs成熟重要因素的IFN即是經(jīng)由TLR3的激活及下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生的。而我們的前期研究發(fā)現(xiàn)TLR3在CHB患者中表達(dá)下調(diào),鑒于TLR3的激活在誘生IFN(IFN為DCs產(chǎn)生,同時(shí)又可作用于DCs,對(duì)后者的成熟和功能具有重要的作用,在HBV的抗感染免疫中非常重要)、以及IFN對(duì)DCs成熟的誘導(dǎo)作用。我們?cè)O(shè)想,是否由于TLR3的表達(dá)下調(diào),使得IFN的表達(dá)下調(diào),進(jìn)而影響了DCs的成熟,導(dǎo)致了D

6、Cs的成熟障礙。為驗(yàn)證這一假設(shè),本研究檢測(cè)了CHB患者外周血DCs TLR3觸發(fā)后Ⅰ型IFN表達(dá)分泌情況,以期評(píng)價(jià)慢性乙型病毒性肝炎患者外周血樹(shù)突狀細(xì)胞的功能狀態(tài),探討其在病毒持續(xù)感染及肝炎慢性化機(jī)制中的可能作用。
　　 慢性乙型病毒性肝炎患者外周血單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞Toll樣受體3觸發(fā)后Ⅰ型干擾素表達(dá)的研究
　　 目的
　　 檢測(cè)慢性乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞TLR3觸發(fā)后Ⅰ型干擾素的表達(dá)

7、分泌情況,評(píng)價(jià)慢性乙型肝炎患者單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞的功能狀態(tài),探討其在病毒持續(xù)感染、肝炎慢性化機(jī)制中的作用。
　　 方法
　　 篩選慢性乙型肝炎患者(CHB組)26例,其外周血用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,再經(jīng)免疫磁珠細(xì)胞分選法獲得純化的單核細(xì)胞,體外誘導(dǎo)培養(yǎng)為樹(shù)突狀細(xì)胞,給予不同濃度的純化HBV相關(guān)抗原(HBsAg、HBeAg、HBcAg)及聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激,在刺激0h,1h,

8、3h,8h,16h,24h,48h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,同時(shí)收集、處理DCs。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA法)測(cè)定血漿及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)蛋白表達(dá)水平,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Real-time PCR法)檢測(cè)Ⅰ型干擾素(IFN-β)的mRNA水平。并用CCK8法檢測(cè)部分研究對(duì)象的DCs功能。同時(shí)以18例健康人(Control組)作對(duì)照。
　　 結(jié)果
　　 1人CD14磁珠陽(yáng)性分選出的CD14

9、+單核細(xì)胞純度＞95％,能滿足體外大量獲取DCs,進(jìn)行后續(xù)DCs實(shí)驗(yàn)的要求。
　　 2不同濃度的純化HBV相關(guān)抗原(HBsAg、HBeAg、HBcAg)刺激后,IFN水平在兩組間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3血漿中IFN-α/β在Control組(18例)(80.98±28.30,115.90±29.14)pg/ml和CHB組(26例)(71.11±10.27,.120.53±26.03)pg/ml,各亞型在兩組間的

10、差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4刺激0h,CHB組(26例)和Control組(18例)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的IFN-α(83.69±15.90,76.09±18.06)pg/ml,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CHB組(26例)和Control組(18例)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的IFN-β(37.65±6.24,40.54±8.84)pg/ml,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5刺激1h,CHB組(26例)和Cont

11、rol組(18例)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的IFN-α(82.21±19.74,78.10±13.87)pg/ml,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CHB組(26例)和Control組(18例)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的IFN-β(37.76±6.60,40.43±8.43)pg/ml,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6刺激3h,CHB組(26例)和Control組(18例)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的IFN-α(83.99±16

12、.05,78.89±12.68)pg/ml,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CHB組(26例)和Control組(18例)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的IFN-β(37.80±8.75,40.97±12.81)pg/ml,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 7刺激8h,CHB組(26例)和Control組(18例)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的IFN-α(86.62±13.34,80.22±16.92)pg/ml,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CHB組

13、(26例)和Control組(18例)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的IFN-β(38.02±7.52,49.16±10.42)pg/ml,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.124,P＜0.05)。
　　 8刺激16h,CHB組(26例)和Control組(18例)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的IFN-α(86.21±14.64,78.71±11.50)pg/ml,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CHB組(26例)和Control組(18例)單

14、核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的IFN-β(58.12±6.58,132.37±51.31)pg/ml,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-7.330,P＜0.05)。
　　 9刺激24h,CHB組(26例)和Control組(18例)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的IFN-α(85.30±16.19,79.02±13.61)pg/ml,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CHB組(26例)和Control組(18例)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的IFN-β

15、(34.24±6.74,48.85±19.42)pg/ml,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.555,P＜0.05)。
　　 10刺激48h,CHB組(26例)和Control組(18例)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的IFN-α(88.99±28.50,80.54±16.72)pg/ml,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CHB組(26例)和Control組(18例)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的IFN-β(31.20±6.71,35.04±6

16、.16)pg/ml,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 11刺激前后,CHB組(26例)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的IFN-βmRNA分別為(3.20±0.77,4.24±0.57),差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Control組(18例)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的IFN-β mRNA分別為(0.89±0.27.5.53±1.40),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.252,P＜0.05)。
　　 12在培養(yǎng)6天后(第7天),慢乙肝

17、患者刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力,在DCs/淋巴細(xì)胞三個(gè)不同比例(1:40,1:20,1:10)時(shí)的刺激指數(shù)均低于正常對(duì)照組(P＜0.01),而在1:80時(shí),CHB組和Control組的刺激指數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;在1:40時(shí),CHB組和Control組的刺激指數(shù)分別為(1.08±0.07,1.97±0.32),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.6476,P＜0.01);在1:20時(shí),兩組的刺激指數(shù)分別為(1.04±0.07,2.67±0.08),

18、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=42.8129,P＜0.01);在1:10時(shí),CHB組和Control組的刺激指數(shù)分別為(1.05±0.09,3.05±0.02),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=52.9503,P＜0.01)。
　　 結(jié)論
　　 1慢乙肝患者外周血DCs在乙肝病毒相關(guān)的抗原刺激下表達(dá)分泌Ⅰ型干擾素的水平較正常人表達(dá)分泌量為少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2 PolyI:C刺激樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)分泌Ⅰ型干擾素的量較乙