顱內(nèi)鐵離子超載在脊髓損傷后中樞性疼痛中的作用研究.pdf

1、脊髓損傷(spinal cold injury，SCI)患者中有60％-90％在損傷發(fā)生后會出現(xiàn)中樞性疼痛(central pain，CP)。中樞性疼痛是一種神經(jīng)性疼痛綜合征，是由脊髓損傷或腦損傷導(dǎo)致的疼痛過敏，其引起的下肢疼痛往往持續(xù)存在并難以忍受，給患者帶來了極大痛苦，因此脊髓損傷后發(fā)生的中樞性疼痛是臨床醫(yī)生不得不面對的難題。
　　目前對于脊髓損傷后中樞性疼痛的發(fā)生機制尚不是十分清楚。近年來越來越多的研究認為脊髓損傷后大腦結(jié)構(gòu)

2、和功能的重塑可能是脊髓損傷后中樞性疼痛的重要原因。
　　在我院前期工作中，我們運用了磁敏感加權(quán)成像技術(shù)(SWI)，對脊髓損傷患者的大腦功能重塑情況展開了研究。發(fā)現(xiàn):脊髓損傷后中樞性疼痛患者腦內(nèi)鐵離子超載的區(qū)域和大腦結(jié)構(gòu)功能重塑的區(qū)域很相似（包括感覺皮層、丘腦等區(qū)域）。這意味著顱內(nèi)鐵離子超載可能參與了中樞性疼痛的發(fā)病。
　　研究發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)鐵離子超載在一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如阿爾茲海默病、帕金森病、腦出血等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著

3、重要作用。以往的研究認為鐵離子的毒性與通過Feteon反應(yīng)直接引起神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，近年來研究發(fā)現(xiàn)，鐵離子超載可以激活腦內(nèi)的小膠質(zhì)細胞，參與到神經(jīng)元損傷的啟動和放大過程。激活的小膠質(zhì)細胞可以調(diào)節(jié)細胞因子如IL-1β、TNF-a以及過氧化物NO的水平;這些前炎癥細胞因子或活性氧化分子所形成的級聯(lián)效應(yīng)進入惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷或丟失。同時又有研究證實:小膠質(zhì)細胞的活化，可能跟細胞內(nèi)NF-κ B信號通路的活化有關(guān)。
　　

4、目的：
　　本研究希望能夠通過實驗了解鐵離子超載及小膠質(zhì)細胞激活在脊髓損傷后中樞性疼痛中發(fā)揮的作用。為應(yīng)用NOS抑制劑、鐵螯合劑、小膠質(zhì)細胞激活抑制劑治療脊髓損傷后中樞性疼痛提供理論基礎(chǔ)。
　　材料與方法：
　　本研究共分為四個部分:
　　(1)脊髓損傷后中樞性疼痛模型構(gòu)建及評價
　　雌性SD大鼠75只，隨機分成5組每組15只。假手術(shù)組:僅行椎板切除術(shù)，未損傷脊髓，不做任何特殊處理。脊髓損傷組:采用Alle

5、n氏重物墜擊法制作脊髓損傷模型，不做任何特殊處理。NOS抑制劑組:造模后應(yīng)用左旋精氨酸(L-arginine)干預(yù)。鐵螯合劑組:造模后應(yīng)用去鐵胺(deferoxamine DFX)干預(yù)。小膠質(zhì)細胞激活抑制劑組:造模后應(yīng)用米諾環(huán)素(minocycline)干預(yù)。通過對手術(shù)后大鼠對后肢和尾部修飾、搔抓、舔咬及自發(fā)嘶叫等自發(fā)痛現(xiàn)象對大鼠自發(fā)痛作出評定，并使用智能熱板儀測定手術(shù)后大鼠后肢熱痛敏潛伏期(PWL)以評定誘發(fā)痛水平。
　　(2)

6、脊髓損傷后腦內(nèi)鐵離子的積累情況:
　　采用原子吸收分光光度法測定大鼠全腦及后肢感覺區(qū)、丘腦、扣帶回組織鐵含量。
　　(3)脊髓損傷后腦內(nèi)鐵離子超載發(fā)生機制
　　采用Real-timePCR法測定各組大鼠后肢感覺皮層、扣帶回、丘腦等區(qū)域內(nèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TfR1）mRNA的表達水平。采用ELISA法測定各組大鼠初級感覺皮層、丘腦、扣帶回中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TfR1)以鐵蛋白(Fn)含量。采用Western Blot檢測各組

7、大鼠后肢感覺皮層內(nèi)鐵調(diào)節(jié)蛋白1(IRP1)、鐵蛋白(Fn)、乳鐵蛋白(Lf)和NF-κ B含量
　　(4)脊髓損傷后小膠質(zhì)細胞活化及其發(fā)生機制
　　通過免疫組織化學(xué)染色法觀察大鼠后感覺皮層內(nèi)小膠質(zhì)細胞活化情況和IRP1含量。
　　本文統(tǒng)計學(xué)處理均采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果以(x)±s表示，選用均值差t檢驗進行組間比較，P＜0.05則認為差異有顯著性。
　　結(jié)果:
　　(1)神經(jīng)源性疼痛

8、的動物模型的自發(fā)痛主要表現(xiàn)為對損傷平面以下搔抓、噬咬現(xiàn)象。脊髓損傷后大鼠出現(xiàn)對損傷部位以下軀體、后爪和尾部的噬咬、搔抓等過度修飾行為，嚴重的甚至出現(xiàn)自殘;而假手術(shù)組中未觀察到以上現(xiàn)象發(fā)生。脊髓損傷組熱痛閾值較其余各組明顯降低(p＜0.05)。觀察各組各時間節(jié)點熱痛潛伏期可見假手術(shù)組在各組間處于較高水平，而脊髓損傷組處于較低水平。
　　(2)各組全腦鐵含量比較未見明顯差異。后肢感覺區(qū)、扣帶回、丘腦鐵含量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組上述腦區(qū)中

9、鐵含量較其余各組明顯降低(p＜0.05)，脊髓損傷組及小膠質(zhì)細胞激活抑制劑組上述腦區(qū)中鐵含量較其余各組明顯升高(p＜0.05)。
　　(3)通過WB法對各組大鼠后肢感覺區(qū)IRP1、Fn、NF-κB、LF含量測定，可發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組后肢感覺區(qū)中IRP1、NF-κB含量較其余各組明顯降低(p＜0.05)，而Fn含量較其他各組明顯升高(p＜0.05)。脊髓損傷組中IRP1、NF-κB含量較假手術(shù)組、NOS抑制劑組、鐵螯合劑組明顯升高(p＜0

10、.05);Fn含量較假手術(shù)組、NOS抑制劑組、鐵螫合劑組明顯降低(p＜0.05)。使用NOS抑制劑可以降低脊髓損傷后IRP1、NF-κB含量，提高Fn含量。使用鐵螯合劑可降低脊髓損傷后NF-κB含量，提高Fn含量，對IRP1含量無影響。使用小膠質(zhì)細胞激活抑制劑對上述蛋白含量無影響。各組中LF比較未見明顯差異。通過ELISA法對各組大鼠后肢感覺區(qū)、丘腦、扣帶回中TfR1、Fn、含量測定，可發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組各腦區(qū)中TfR1含量較其余各組明顯降低

11、(p＜0.05)，而Fn含量較其他各組明顯升高(p＜0.05)。脊髓損傷組中TfR1含量較假手術(shù)組、NOS抑制劑組、鐵螯合劑組明顯升高(p＜0.05);Fn含量較假手術(shù)組、NOS抑制劑組、鐵螯合劑組明顯降低(p＜0.05)。使用精氨酸可以降低脊髓損傷后TfR1含量(p＜0.05)，提高Fn含量(p＜0.05)。使用去鐵胺后可提高脊髓損傷后Fn含量(p＜0.05)，對TfR1含量無影響。使用米諾環(huán)素對TfR1、Fn蛋白含量無影響。通過RT

12、-PCR法對各組大鼠后肢感覺區(qū)、丘腦、扣帶回中TfR1基因含量測定可發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組各腦區(qū)中TfR1基因含量較其余各組明顯降低(p＜0.05)，脊髓損傷組中TfR1基因含量較假手術(shù)組、NOS抑制劑組明顯升高(p＜0.05);使用精氨酸可以降低脊髓損傷后TfR1含量(p＜0.05)。
　　(4)通過對各組大鼠后肢感覺區(qū)內(nèi)的小膠質(zhì)細胞進行免疫組化法染色可觀察到:脊髓損傷后小膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯增加激活狀態(tài)使用NOS抑制劑、鐵螯合劑、小膠質(zhì)細胞

13、激活抑制劑干預(yù)后，小膠質(zhì)細胞數(shù)目減少且激活程度減低。通過對各組大鼠后肢感覺區(qū)內(nèi)的IRP1進行免疫組化法染色可觀察到:脊髓損傷后IRP1數(shù)量明顯增加，使用NOS抑制劑干預(yù)后，IRP1含量減少。
　　結(jié)論：
　　(1)采用Allen氏重物墜擊法建立大鼠脊髓損傷模型可以誘發(fā)損傷平面以下的中樞性神經(jīng)性疼痛;
　　(2)脊髓損傷后大鼠全腦鐵含量保持恒定。丘腦、扣帶回、后肢感覺區(qū)出現(xiàn)了IRP1升高、TfR1升高、Fn降低，鐵離子含

14、量增高，后肢感覺區(qū)出現(xiàn)了小膠質(zhì)細胞的激活;
　　(3)使用NOS抑制劑干預(yù)可以使大鼠腦內(nèi)丘腦、扣帶回、后肢感覺區(qū)內(nèi)IRP1降低、TfR1降低、Fn升高，降低上述腦區(qū)內(nèi)鐵含量，抑制后肢感覺區(qū)內(nèi)小膠質(zhì)細胞激活，增高損傷平面以下熱痛閾值;
　　(4)通過鐵螯合劑干預(yù)可以使大鼠腦內(nèi)丘腦、扣帶回、后肢感覺區(qū)內(nèi)Fn升高，降低上述腦區(qū)內(nèi)鐵含量，抑制后肢感覺區(qū)內(nèi)小膠質(zhì)細胞激活，增高損傷平面以下熱痛閾值;
　　(5)采取小膠質(zhì)細胞激活抑

15、制劑干預(yù)可以使抑制大鼠腦內(nèi)后肢感覺區(qū)內(nèi)小膠質(zhì)細胞激活，增高損傷平面以下熱痛閾值;
　　(6)在脊髓損傷后存在著如下通路導(dǎo)致了中樞性神經(jīng)性疼痛的發(fā)生:脊髓損傷引起應(yīng)激狀態(tài)→下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活→糖皮質(zhì)激素的異常增高→一氧化氮合酶激活→NO自由基增多→鐵調(diào)節(jié)蛋白/鐵反應(yīng)元件活化→顱內(nèi)鐵離子超載→NF-κ B信號通路活化→小膠質(zhì)細胞激活→腦功能性重構(gòu)→中樞性神經(jīng)性疼痛產(chǎn)生。
　　(7)應(yīng)用NOS抑制劑、鐵離子螯合劑、小膠質(zhì)