自噬在丙戊酸治療脊髓損傷中的作用研究.pdf

1、脊髓損傷(Spinalcordinjury,SCI)是指由直接或間接外力損傷脊髓，在損害的相應節(jié)段出現各種運動、感覺和括約肌功能障礙等，是致殘、致死率極高的危重性疾病。在當今社會，隨著交通事故、礦井災難、建筑事故及暴力傷害等使得脊髓損傷的人員逐年上升，給社會造成了的巨大的經濟負擔，患者的生活質量明顯下降。
　　雖然對于脊髓損傷的治療有了很大的進展，但是由于其發(fā)病機制并不完全清楚，所以針對脊髓損傷的臨床治療特別是對其運動功能恢復的治

2、療效果并不十分理想。因此，進一步了解與脊髓損傷病情發(fā)展相關的機制及尋求更好更快捷的治療方法，提高患者的生活質量是我們迫切需要關注的問題。
　　創(chuàng)傷后運動功能下降的機制有很多，目前也取得了很多的進展。近年來，發(fā)現創(chuàng)傷后全身應激反應明顯，特別是中樞神經系統(tǒng)處于應激狀態(tài)，保持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的自噬在其中發(fā)揮著重要的作用。自噬可以通過降解損傷的細胞器及蛋白來維持細胞的穩(wěn)態(tài)，但是其具有雙刃劍的作用。眾多研究表明，創(chuàng)傷引起的脊髓損傷后自噬是升高的，

3、而且影響脊髓功能的恢復。如果我們能夠掌握脊髓損傷過程中自噬表達的時間特征并對其進行有效的調整，可能會對脊髓功能的恢復起到一定的治療作用，為脊髓損傷的治療提供新的方向。
　　對于自噬的治療，我們需要尋找一種抑制自噬，且同時不會對機體造成損傷的方法。近年來發(fā)現組蛋白去乙酰化酶抑制劑在許多神經疾病中具有保護作用。丙戊酸是一種組蛋白去乙?；敢种苿?，有研究表明，在腫瘤組織中可以抑制自噬，提示這種藥物可能對于自噬具有一定的作用，那么這種作用

4、應該會對脊髓損傷的恢復有幫助。
　　本研究從動物實驗與細胞研究兩個方面開展了相關的工作。研究內容包括以下3個部分:
　　1觀察脊髓損傷后脊髓組織自噬的變化特征。
　　2觀察丙戊酸治療脊髓損傷后脊髓組織自噬及運動功能的變化。
　　3選用SH-SY5Y細胞，建立細胞損傷模型，將Beclin-1基因過表達，明確自噬在丙戊酸治療脊髓損傷中的作用。
　　第一部分大鼠脊髓損傷后脊髓組織自噬的表達特征研究目的
　　

5、建立大鼠脊髓挫傷模型，觀察脊髓損傷后不同時間點自噬相關因子Beclin-1和LC3的蛋白及mRNA表達，明確脊髓損傷后自噬表達特征。從而為揭示繼發(fā)性脊髓損傷的可能機制提供研究條件，并奠定研究基礎。
　　研究方法
　　1.實驗動物
　　健康雄性Wistar大鼠，體重220~250g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。
　　2.建立大鼠脊髓損傷模型：
　　脊髓損傷模型：應用改良的NYUImpactor(脊髓損傷撞

6、擊儀)裝置造模法，即用10g重物從25mm的高度落下打擊脊髓背側造成不同程度的損傷，該模型與人類脊髓損傷的性質非常相近，兩者均屬一定力量撞擊后造成脊髓水腫、缺血，并繼發(fā)一系列損傷反應。以T10為標志，暴露大鼠T9-11椎板，咬除T10的棘突及椎板，調整立體定位儀的立臂將沖擊桿對準T10脊髓，將10g重的沖擊桿自25mm高度處下落撞擊脊髓，沖擊桿下落后大鼠迅速出現搖尾反射，雙后肢及軀體回縮撲動，表明撞擊成功。沖擊桿與脊髓的接觸面有輕微的凹

7、槽，以防止損傷脊膜。沖擊桿底部直徑為2.5mm，略小于脊髓直徑，當它壓迫脊髓時能夠清楚的顯示椎管的邊緣
　　3.Real-timePCR及Westernblot標本采集
　　假手術組術后立即取材，脊髓損傷大鼠術后1h、2h、6h、24h、48h、72h取材，每組分別取6只大鼠，麻醉后取出包含損傷中心長約1cm的脊髓組織，立即置于-80℃冰箱保存，用于提取其總RNA及蛋白。
　　4.Westernblot測定LC3和Be

8、clin-1的蛋白含量
　　將脊髓組織勻漿、離心后取上清，用BCA法測定蛋白濃度。配制15％凝膠，上樣（上樣量LC3及Beclin-1均為40μg/孔）、電泳、轉膜（半干式）、封閉、經過一抗、二抗反應后，進行化學發(fā)光，利用ImagJ1.44p軟件進行條帶分析。用目的蛋白的灰度值除以內參β-actin的灰度值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量。
　　5.Real-timePCR測定LC3和Beclin-1的mRN

9、A表達。
　　脊髓組織總RNA提取后，按照說明書將提取的RNA在一定的反應體系及反轉錄條件下合成cDNA，然后取2ulcDNA與上游引物、下游引物、水及SYBR?PremixExTaqTM在Mx3005PReal-TimePCR儀上進行擴增，記錄Ct值、擴增曲線及溶解曲線。并相對定量結果計算（2-ΔΔCt法）。
　　ΔCt目的基因=Ct實驗組目的基因-Ct對照組目的基因
　　ΔCtGAPDH=Ct實驗組GAPDH-Ct

10、對照組GAPDH
　　-ΔΔCt=-(ΔCt目的基因-ΔCtGAPDH)
　　6.免疫熒光染色
　　脊髓損傷后2h，損傷中心冰凍切片進行免疫熒光染色，經過洗片、封閉之后，孵育一抗Anti-LC3和Anti-Beclin-14℃冰箱過夜，洗片后孵育相應的山羊抗小鼠或山羊抗兔的熒光二抗，再次洗片后DAPI染色3min，洗片，封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。
　　7.統(tǒng)計處理
　　實驗結果以均數±標準差（Mean±S

11、D）表示，兩組間均數比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，使用SPSS15.0統(tǒng)計軟件對數據進行統(tǒng)計分析。*P<0.05認為具有統(tǒng)計學意義。
　　結果
　　1脊髓損傷大鼠模型建立成功
　　所有大鼠在術后都得以存活。SCI前、術后2h、術后24h，生理學參數（包括平均動脈血壓，PH值，體溫，血氣分析，血糖）在脊髓損傷組和VPA治療組沒有明顯的不同。（見表1）。10g重的沖擊桿從自25mm高度處以自由

12、落體落下，金屬桿下落后大鼠迅速出現搖尾反射，雙后肢及軀體回縮撲動，表明撞擊成功。
　　2脊髓損傷后脊髓組織自噬表達增高
　　大鼠胸椎T10挫傷后，在不同的時間點脊髓組織自噬的表達發(fā)生了明顯的變化。通過Westernblot和Real-timePCR法檢測了LC3和Beclin-1的蛋白及mRNA水平的表達。自脊髓損傷后1h開始自噬標記物Beclin-1和LC3的蛋白及mRNA表達就開始增加，在損傷后1h，2h，6h其差異具有

13、統(tǒng)計學意義（*p<0.05），并且其表達水平在損傷后2h達到高峰(**p<0.01)。(見圖1-4)
　　3脊髓損傷促進了LC3及Beclin-1的免疫熒光表達
　　脊髓損傷后2h，通過激光共聚焦顯微鏡觀察LC3及Beclin-1的免疫熒光表達情況，結果顯示，與假手術（sham組）相比，脊髓損傷后脊髓組織LC3及Beclin-1的蛋白聚點增加，表示其表達增加。
　　小結
　　脊髓損傷后脊髓組織中自噬水平明顯增強，

14、通過Real-timePCR、Westernblot、免疫熒光方法，檢測到脊髓損傷后1h始其自噬水平開始上升，2h達到高峰。
　　第二部分丙戊酸抑制了大鼠脊髓損傷后脊髓組織自噬的表達并促進了其功能的康復
　　研究目的
　　研究丙戊酸治療脊髓損傷后脊髓組織自噬水平的變化以及丙戊酸在神經保護及功能康復中的作用。
　　研究方法
　　1丙戊酸治療
　　脊髓損傷后兩組動物隨機配對給藥和生理鹽水，脊髓損傷后立即給

15、予腹腔注射丙戊酸，300mg/kg，Bid。對照組及假手術組給予等量的生理鹽水進行腹腔注射。給藥周期為2周。
　　2丙戊酸治療脊髓損傷后LC3及Beclin-1的蛋白及mRNA水平的測定
　　脊髓損傷后2h，通過Westernblot及Real-timePCR法檢測脊髓組織LC3及Beclin-1的蛋白及mRNA水平的變化。
　　3丙戊酸對脊髓損傷大鼠神經保護作用的測定
　　3.1通過LuxolFastblue對

16、髓鞘進行染色
　　將切片置入95%酒精中5min，0.1%LuxolFastblue（LFB）溶液中57℃過夜。95%乙醇溶液洗去過多的染液，雙蒸水浸洗后，切片置入0.05%的碳酸鋰和70%的酒精中反復分化幾次，直到灰質和白質分界清楚。評估了跨度4mm的包含損傷中心的9個切片，在顯微鏡下對其照相×40倍，并用ImageJ1.44p軟件定量分析脊髓白質中LFB陽性面積，計算損傷組織切片中LFB陽性面積與正常組織切片總面積的比率。

17、r>　　3.2通過尼氏染色對脊髓前角運動神經元進行染色
　　收集包含損傷中心在內的9張切冰凍片，切片放入1:1酒精/氯仿中過夜，然后放入95%酒精中及雙蒸水中浸洗，0.1%焦油紫溶液中37℃10min進行染色。然后對切片雙蒸水浸洗，95%酒精中分化1min，脫水，透明，封片。奧林巴斯顯微鏡下對切片照相并對脊髓前角運動神經元進行計數，計數面積為從橫切面的一側經中央管向另一側畫一水平線，對軀體同側的脊髓前角運動神經元予以計數，并通過I

18、mageJ1.44p軟件進行人工定量。
　　4.丙戊酸對脊髓損傷大鼠行為學影響的評定
　　術后每周行BBB評分，共6周。為保證評分的準確性，由3位非實驗人員了解評分標準后，各自評分，取平均值。
　　5.統(tǒng)計處理
　　實驗結果以均數±標準差（Mean±SD）表示，兩組間均數比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析。使用SPSS15.0統(tǒng)計軟件對數據進行統(tǒng)計分析。*P<0.05認為具有統(tǒng)計學意義。<

19、br>　　結果
　　1丙戊酸促進神經保護及功能的康復
　　1.1丙戊酸減少了大鼠脊髓損傷后脊髓髓鞘的損害
　　脊髓損傷后42天，應用LFB染色評估髓鞘存活情況。與損傷組相比，丙戊酸治療組脫髓鞘的面積明顯的減少了。損傷組和丙戊酸組脊髓組織橫切面的總面積都比正常組的總面積小，但是丙戊酸組存活的髓鞘明顯多于損傷組。通過定量分析，在距離損傷中心1mm處的頭側，丙戊酸組（30.96%±0.58%）存活的髓鞘面積明顯大于損傷組（1

20、9.67±0.83%），差異有統(tǒng)計學意義(*p<0.05)。(見圖7)
　　1.2丙戊酸增加了大鼠脊髓損傷后脊髓前角運動神經元的數量
　　脊髓損傷后42天，應用尼氏染色法對脊髓組織冰凍切片進行染色，并計算脊髓前角運動神經元的數目。與損傷組相比，丙戊酸組脊髓前角運動神經元明顯增多。尤其是在距損傷中心上、下2mm處，其軀體同側脊髓前角運動神經元的數量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（*p<0.5）(見圖8)
　　1.3丙戊酸促進